使用嵌入核酸检测核酸中甲基化改变的分析制造技术

本发明专利技术公开了检测样品中靶核酸存在的方法，包括用修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂处理含核酸的样品；向处理过的样品以嵌入核酸（ＩＮＡ）形式提供能够结合到核酸靶区域的检测配体，允许检测配体结合到靶核酸足够的时间；和检测检测配体结合到样品中核酸分子以指示靶核酸的存在。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及DNA杂交分析和改进的寡核苷酸或嵌入核酸(INA)分析。本专利技术特别涉及使用这些分析区分DNA中包含5甲基胞嘧啶碱基的特定碱基序列的方法。
技术介绍
许多方法可以用于检测具体的核酸分子。这些方法一般地依靠靶DNA和核酸探针之间序列依赖的杂交，所述探针长度可以从短的寡核苷酸(20碱基或更少)到数千碱基的序列。对直接检测而言，靶DNA最常见根据凝胶电泳确定的大小而分离并在用与靶序列互补的探针杂交(Southern和Northern印迹)前转移到固相支持物中。探针可以是天然的核酸或类似物例如INA或锁核酸(LNA)、PNA、HNA、ANA和MNA。该探针可被直接标记(如使用32P)或可以使用间接的检测方法。间接的方法通常依靠向该探针掺入“标记”例如生物素或地高辛配基，然后该探针通过例如酶联底物转化或化学发光的方法检测。另一个广泛使用的直接检测核酸的方法为“夹心”杂交。在此方法中，捕捉探针连接到固相支持物上，溶液中的靶DNA与结合的探针杂交。未结合的靶DNA被冲洗去，而结合的DNA使用杂交到靶序列的第二探针检测。检测可以使用以上概述的直接或间接法。“分支DNA”信号检测系统是运用夹心杂交原理(Urdea Ms分支DNA信号扩增，Biotechnology 12926-928)的例子。运用核酸杂交直接检测核酸序列的迅速成长的领域是DNA微阵列(Young RA Biomedical discovery with DNA arrays.Cell 1029-15(2000)；Watson，New tools.A new breed of high tech detectives.Science289850-854(2000))。在这个方法中，单个核酸种类，其可以从寡核苷酸变动到更长的序列例如cDNA克隆，被固定到网格形状的固相支持物上。加标签的或标记的核酸群体然后与所述阵列杂交，定量阵列中与各斑点的杂交水平。最常见的是放射活性的或荧光标记的核酸(例如cDNAs)用于杂交，尽管其他的检测系统也被采用。从核酸序列群体中扩增具体序列最广泛使用的方法是聚合酶链式反应(PCR)(Dieffenbach C和Dveksler G编，PCR PrimerA LaboratoryManual。Cold Spring Harbor Press，Plainview NY)。在这个扩增方法中，寡核苷酸，通常位于互补DNA链上15到30核苷酸长度，处于待扩增的DNA区域的任一端，用来在变性的单链DNA上引发DNA合成。使用热稳定的DNA聚合酶进行逐次循环的变性、引物杂交和DNA链合成使得引物之间的序列得以指数的扩增。RNA序列可以通过首先使用反转录酶复制生产互补DNA拷贝而扩增。扩增的DNA片段可以通过多种的方法检测，包括凝胶电泳、与标记的探针杂交、使用能后续识别的加标签引物(例如通过酶联分析)、使用在与靶DNA杂交时产生信号的加荧光标签的引物(例如Beacon和TaqMan系统)。除PCR之外，其他的方法已经开发用于检测和扩增具体的序列。一个例子为连接酶链式反应(Barany F使用克隆热稳定连接酶检测遗传病和扩增DNA(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88189-193(1991)). 目前供选的检测DNA中甲基化改变的方法取决于此种序列在DNA的亚硫酸氢盐修饰以后的PCR扩增，所述甲基化改变例如在前列腺癌GSTP1基因启动子区域发现的。在亚硫酸氢盐处理的DNA中，胞嘧啶被变为尿嘧啶(由此在PCR过程中被扩增成胸腺嘧啶)而甲基化胞嘧啶是非反应性的，保持为胞嘧啶(Frommer M，McDonald LE，MillarDS，Collis CM，Watt F，Grigg GW，Molloy PL和Paul CL在单个DNA链中产生5-甲基胞嘧啶残基的正显示的基因组测序方案。PNAS891827-1831(1992)；Clark SJ；Harrison J，Paul CL和Frommer M.高灵敏的甲基化胞嘧啶作(High sensitivity mapping of methylatedcytosines).Nucleic Acids Res.222990-2997(1994)).因此(在亚硫酸氢盐处理后)包含5-甲基胞嘧啶碱基的DNA在序列上与对应的未甲基化DNA不同。Frommer等1992的结果是亚硫酸氢盐方法用于在DNA中测序5-甲基胞嘧啶残基的基础。若干年后这个分析被用作US5786146中CpG岛甲基化状态的PCR分析的基础。引物可以选择来非选择性扩增目的基因组区域以确定其甲基化状态，或可以设计成能有选择地扩增其中特定的胞嘧啶被甲基化的序列(Herman JG，GraffJR，Myohanen S，Nelkin BD和Baylin SB.Methylation-specific PCRanovel PCR assay for methylation status of CpG islands.PNAS 939821-9826(1996)). 另外的用于检测胞嘧啶甲基化的方法包含用其切割能被位点特异的DNA甲基化阻断的限制性内切酶消化，继之以Southern印迹和对目的区杂交探针分析。该方法局限于在所述位点处DNA被甲基化具有显著的比例(通常＞10％)，和有足够的检测DNA，通常10pg的情形。用其切割被位点特异的DNA甲基化阻断的限制性内切酶消化，继之以使用限制性内切酶位点两侧的引物进行PCR扩增。这个方法可以利用较少量的DNA，但由于DNA甲基化之外的原因任何缺少完全的酶解作用都可导致假阳性信号。若干年前，已经开发其中全部的脱氧核糖磷酸骨架已经用在结构上同型的不带电的聚酰胺骨架替换的肽核酸(PNA)，所述聚酰胺骨架包括N-(2-氨乙基)甘氨酸单位(Ray A和Norden B.Peptide nucleic acid(PNA)its medical and biotechnical applications and for the future.FASEBJ 141041-1060(2000)). 已经开发了利用PNA配体用于灵敏地和特异地检测DNA的方法，其不要求PCR扩增(WO 02/38801)。最近，一种新的DNA配体，嵌入核酸(INA)已经被开发，其具有独特的有用性质本专利技术人已经开发使用INA探针用于检测目的核酸的新分析方法。专利技术详述第一方面，本专利技术提供检测样品中靶核酸存在的方法，该方法包括(a)用修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂处理含核酸的样品；(b)向处理过的样品以嵌入核酸(INA)形式提供能够结合到核酸的靶区域的检测配体，并让测检配体与靶核酸结合足够的时间；和(c)测量检测配体与样品中核酸分子的结合以检测样品中靶核酸的存在。第二方面，本专利技术提供检测样品中靶核酸甲基化的方法，该方法包括(a)用修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂处理含核酸的样品；(b)向处理过的样品以嵌入核酸(INA)形式提供以能够区别核酸甲基化和未甲基化的胞嘧啶的检测配体，并允许检测配体与靶核酸结合足够的时间；和(c)检测检测配体与样品中核酸的结合，这样的结合是靶核酸甲基化程度的指示。第三方面，本专利技术提供检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测样品中靶核酸存在的方法，包括：用修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂处理含核酸的样品；向处理过的样品以嵌入核酸（ＩＮＡ）形式提供能够结合到核酸靶区域的检测配体，并允许检测配体与靶核酸结合足够的时间；以及检测检测配体与样品中核酸分子的结合以表明靶核酸的存在。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：道格拉斯斯彭切尔米勒，约翰罗伯特梅尔基，杰夫雷W格里格，乔治L加博尔米克洛斯，
申请(专利权)人：人类遗传标记控股有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]