酿酒酵母基因的筛选方法技术

本发明专利技术的目标是提供对于参与所期望酿造特性的基因进行选择的方法，所述方法以这样的方式进行，即汇编了工业酵母尤其是用于酒精饮料如啤酒的酿酒酵母的全部基因组序列数据的数据库被制备；参与酿酒酵母所特异拥有的酿造特性的基因被从数据库中选出；以及基因的功能分析通过破坏或过表达而进行，并提供基于汇编了工业酵母或者尤其是酿酒酵母的全部基因组序列（被附着在固体平板上）数据的数据库的ＤＮＡ阵列（其中寡核苷酸被选定）。另一目标是提供酵母（其具有基因参与的酿造特性）的培育方法，以及生产醇或酒精饮料的方法（其中产量和质量都应用酵母而被改善）。另一目标是提供酿酒酵母所特异的基因和基因所编码的肽。实现上述目标的手段是对在醇或酒精饮料生产中参与产量增加和／或风味改善的基因进行筛选的方法，其特征在于：（Ａ）工业酵母的全部基因组序列得到分析，（Ｂ）基因组序列与啤酒糖酵母的全部基因组序列进行了比较，（Ｃ）与啤酒糖酵母的基因所编码的氨基酸序列有７０到９７％同一性的工业酵母的氨基酸序列的编码基因被选出，及（Ｄ）进行基因的功能分析，由此鉴定基因所赋予酵母的特性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于生产酒精饮料如啤酒、日本米酒或燃料酒精等的工业酵母的基因尤其是用于生产酒精饮料的酿酒酵母的基因的筛选方法。更特别的是，它涉及酒精饮料生产中的一定方法，其中酿酒酵母的DNA序列信息被汇编到数据库中以便参与产量增长和/或风味改善例如风味的稳定化、增强等的基因被选出，也涉及适合酿造(其中基因表达受到控制)的酵母例如选定基因被破坏的酵母或基因过表达的酵母的培育方法，还涉及应用培育的酵母生产酒精饮料的方法。
技术介绍
生产燃料酒精、酒精饮料如啤酒或日本米酒等的技术已应用工业酵母而得到发展。特别是在应用酿酒酵母的酒精饮料生产中，已在增加产量和改善风味例如酒精饮料风味的稳定化或强化的技术中见到活跃的发展。全球消费最多的酒精饮料是啤酒，2001年全球生产的啤酒数量是大约140,000,000kL。啤酒类型根据酵母类型和发酵方法大致分成三类。这三类是，自然发酵型啤酒，其中发酵应用存活在啤酒厂中的酵母和微生物而进行；ale类型啤酒，其中发酵应用属于啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的表层发酵酵母在20到25℃的温度下进行，而随后的成熟时间被缩短；和Large类型啤酒，其中发酵应用属于巴斯德氏糖酵母(Saccharomyces pastorianus)的底部发酵酵母在6到15℃的温度下进行，然后经历低温成熟过程。现在，全球生产的啤酒不少于90％是Large类型啤酒，因此，用于酿制Large类型啤酒的底部发酵酵母已被最广泛地应用在啤酒酿造中。在应用包括上述提及的酿酒酵母的微生物进行生产的所谓发酵生产中，重要的是发酵过程最优化以及有用的菌株被选出和培育，以增加产量和改善产品质量。在啤酒酿造最优化的情形中，已实施了某一方法，其中一定量的酵母代谢物例如醇(如乙醇)、酯、有机酸等被监测，然后是温度、气流数量、原材料含量等被控制。在这一情形中，酵母细胞的材料吸收和排泄及细胞中的代谢进行暗箱操作，而只进行非常肤浅的控制。此外，为了例如对酒精饮料给出高风味的目的，用于抑制啤酒酿造过程中氧供应量等的过程控制方法已被尝试。然而在这一方法中，酵母自身的生长率因为供氧不足被降低，而负面效应例如发酵的阻滞和/或啤酒质量的退化可能出现。因此，通过优化发酵过程的方式对产量和啤酒质量进行改善方面，存在一定的限制。另一方面，关于有用的工业酵母例如有用的啤酒酵母的培育方法，除了实际培育(actual breeding)外，用于选出合意株系的技术已被广泛应用。啤酒酿造本身在巴斯德发现微生物之前已很好地进行，并且在啤酒酿造中，从啤酒厂应用的多种酵母株中选出更适合的啤酒酵母株的方法一直传统性地实施，但是几乎没有具有良好特性的酵母被培育出。作为阳性培育方法的实例，存在一种方法，其中应用化学物质或放射性射线所致的人工基因突变。然而，酿酒酵母尤其啤酒酿造中广泛应用的底部发酵酵母在许多情形中是多倍体。在那种情况下，不可能产生出合意的突变体，除非突变在所有将被突变的等位基因发生。因此，虽然在实验室单倍体酵母的情形中有可能诱导出合意的突变，但在多倍体的啤酒酵母的情形中，基本上是不可能的。近年来已尝试一定的培育方法，其中突变或杂交培育通过应用从底部发酵酵母分离出的孢子而进行(参考，例如，非专利文献1)。然而，底部发酵酵母是多倍体，并具有复杂的染色体结构，因此，具有增殖能力的孢子的分离有困难，而且几乎不可能由此得到具有良好特性的菌株。另一方面，所需的基因应用基因工程技术而被引入和在酿酒酵母中表达，近来已成为可能，由此也有可能通过应用基因功能分析的结果和已被进行功能分析的基因而培育具有所需特征的酵母。然而，与全部基因组序列已被阐明的面包酵母(啤酒糖酵母；参考，例如，非专利文献2)相比，底部发酵酵母的全部基因组序列尚未阐明，并且关于参与底部发酵酵母所特异的酿酒特性的基因和所述基因在啤酒酿造中的功能，只有非常少数的发现。近年来，转录子分析已应用DNA微阵列进行，其中DNA片段或核苷酸寡聚物(每一个都具有结构基因或染色体的内区域的部分序列)被固定在固体支持物上。例如，Olesen，等人在酿造过程中应用GeneFilters(Research Genetics Co.制造)进行了底部发酵酵母的广泛的基因表达分析(参考，例如，非专利文献3)。然而，既然底部发酵酵母的全部基因组序列尚未被阐明，则什么基因被监控以精确地表达也是不明确的。因此，这类信息非常不充分，而无法应用于底部发酵酵母的代谢分析、有用酵母的培育及啤酒酿造过程的控制。现在，超过100个微生物物种的全基因组序列已被确定(参考，例如，非专利文献6)，包括啤酒糖酵母，大肠杆菌(Escherichia coli)(参考，例如，非专利文献4)和结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)(参考，例如，非专利文献5)。根据已确定的DNA序列，这些微生物的基因被鉴别，大量基因的功能在没有进行遗传、生化和分子生物学实验的情况下被预测。然而，工业酵母例如酿酒酵母具有高度多倍体性和复杂染色体结构，并因推测其装配(连接DNA序列的操作)将会有困难。因此，包含两种不同类型基因组(参考，例如，非专利文献7)的底部发酵酵母的全基因组序列尚未被报道。在具体的醇或酒精饮料生产中，存在着在产品中增加亚硫酸(sulfite)浓度以控制风味的技术。亚硫酸已知为具有抗氧化活性的化合物，并在食品、饮料和制药以及酒精饮料领域中被广泛用作抗氧化剂。例如，对葡萄酒而言，需要较长的成熟期，亚硫酸对其质量的保存起重要作用。也已知，在啤酒酿造中，质量保存期根据产品中包含的亚硫酸的浓度增加而变长。因此，当产品中亚硫酸的数量增加时，有可能制备具有极佳的风味稳定性和质量保存期较长的产品。增加产品中亚硫酸数量的最简单方式是添加亚硫酸。在日本，就葡萄酒而言，经健康、劳动和福利部(Ministry of Health，Labor andWelfare)允许，以残余亚硫酸浓度计，可添加亚硫酸至不超过350ppm的程度。然而在那种情形中，既然亚硫酸被归类为食品添加剂，当考虑到消费者对食品添加剂的负面印象时，添加亚硫酸到啤酒中就不太合适。然而，用于酿造的酵母通过将介质中的硫酸盐还原而生成了硫化氢，以合成含硫的代谢物，例如含硫的氨基酸。亚硫酸是该途径的中间代谢物。如果发酵期间亚硫酸被有效地排出细胞，则麦芽汁和产品中的亚硫酸数量都会增加。有两个方法可以在发酵过程中增加麦芽汁里的亚硫酸浓度。一是控制发酵过程而另一个是培育酿酒酵母。至于发酵过程的调控，发酵过程中产生的亚硫酸的数量与溶解氧的浓度成反比，因此，已尝试某一方法，其中溶解氧的浓度被减少，以便增加亚硫酸的数量，同时亚硫酸的氧化被抑制。然而，在该方法中，酵母的生长速率因氧气的缺乏而减少，这会具有负效应例如发酵的阻滞和质量的退化。因此，该方法不实用。另一方面，如上面提及的，培育酿酒酵母的基因工程技术已得到发展。例如，有某些报道关注酵母的硫代谢。亚硫酸(SO2)是含硫氨基酸和维生素合成的中间产物，通过硫酸离子(SO42-)→APS(腺嘌呤硫酸)→PAPS(磷酸腺嘌呤硫酸)→亚硫酸离子(SO32-)的途径产生，其中硫酸离子从细胞外被整合。曾经尝试增加MET3基因和MET14基本文档来自技高网...

【技术保护点】
对于在醇或酒精饮料生产中参与产量增加和／或风味改善的基因的筛选方法，特征在于：（ａ）工业酵母的全部基因组序列被分析，（ｂ）这些序列与啤酒糖酵母的那些序列进行比较，（ｃ）与啤酒糖酵母的基因所编码的氨基酸序列具有７０到９７％同一性的工业酵母的氨基酸序列的编码基因被选出，及（ｄ）对选出的基因进行功能分析，由此鉴定所述基因所赋予酵母的特性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：中尾嘉宏，中村规尚，儿玉由纪子，藤村朋子，芦刈俊彦，
申请(专利权)人：三得利株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]