一种土壤总DNA小量快速提取方法技术

本发明专利技术公开了一种土壤总ＤＮＡ的小量快速提取方法。以土壤为材料，采取石英沙、二氧化硅粉末振荡和十六烷基三甲基溴化铵共同裂解细胞释放ＤＮＡ，释放的ＤＮＡ在弱酸性或偏中性ｐＨ值和高浓度硫氰酸根离子下可被硅藻土吸附，当条件改变后，在弱碱性下ＤＮＡ又被低盐缓冲液或去离子水洗脱出来，这样提取的ＤＮＡ具有足够的纯度和量用于ＰＣＲ和酶切反应。主要步骤包括裂解细胞、抽提ＤＮＡ和纯化ＤＮＡ三步。本发明专利技术具有简单、快速、方便、提取的ＤＮＡ纯度高和价格便宜等优点，而且可应用于试剂盒的制作，在半小时左右提取比较纯的土壤总ＤＮＡ，用于土壤微生物学和分子生物学研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物学和分子生物学
，具体涉及从土壤中小量快速提取总DNA的方法。
技术介绍
目前通常用于土壤总DNA提取的方法主要有间接法(Andrew E.Berry，Claudia Chiocchini，TinaSelby，Margherita Sosio，Elizabeth M.H.Wellington.(2003)Isolation of high molecular weight DNA from soil forcloning into BAC vectors.FEMS Microbiology Letters.22315-20)、直接法(Zhou，J.，Mary Ann Bruns，M.A.，andTiedje，M.J.(1996)DNA Recovery from Soils of Diverse Composition.Applied and Environmental Microbiology62(2)316-322)和试剂盒法(Q.BIOgene公司的FastDNA SPIN Kit for Soil)，中国专利技术专利申请公开说明书(公开号CN1456684A，专利申请号03120964.5)公开了“一种PCR-DGGE研究环境微生物群落的引物设计方案”，其提取土壤总DNA的方法也为直接法。从土壤中提取总DNA的间接法是先分离细胞再裂解，由于许多微生物与土壤颗粒紧密结合，细胞不易分离，导致最终的DNA产量低，还非常费时，此法一般少用；直接法是直接从土壤中裂解细胞，该法费时且效果一般；试剂盒法具有简单、快速，但价格昂贵，对大批样品的提取不经济。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有方法存在的缺陷，建立一种操作简单、快速、方便且价格经济的新方法。目前国内还没有土壤DNA提取试剂盒，该方法可用于制作试剂盒，在半小时左右提取比较纯的土壤总DNA，直接作为PCR的模板和酶切的底物，用于土壤微生物学和分子生物学的操作。 本专利技术通过以下技术方案实现本申请人专利技术了一种土壤总DNA小量快速提取的新方法。以土壤为材料，采取物理和化学方法共同裂解细胞释放DNA(即石英沙、二氧化硅粉末振荡和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)联用)，释放的DNA在弱酸性或偏中性pH值和高浓度硫氰酸根离子(SCN-)下可被硅藻土(主要成分为二氧化硅)吸附，当条件改变后，在弱碱性下DNA又被低盐缓冲液或去离子水洗脱出来，这样得到的DNA具有足够的纯度和量用于PCR和酶切反应。 本专利技术包括以下步骤本专利技术的主要步骤包括细胞裂解、DNA抽提和纯化。其具体步骤如下(1)制作裂解管称取石英沙和二氧化硅粉末各10克，先用稀硝酸洗涤，然后用去离子水洗涤并浸泡过夜，再在80℃下烘干，精确称取烘干的石英沙和二氧化硅粉末各0.3克，装入2ml的离心管，121℃灭菌30分钟；(2)称取土样0.5克到步骤(1)的裂解管中，加裂解缓冲液(裂解缓冲液的制备0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA，0.1MH3PO4Buffer，1.5M NaCl，pH8.0，121℃灭菌30分钟后加CTAB，使其终浓度为1％(克/毫升))1毫升后混匀；(3)用胶带将裂解管固定在旋涡混合仪(产自江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司，产品型号为QL-901型)上振荡5分钟；(4)在10,000×g下离心1分钟后将尽可能多的上清液转至一洁净的1.5毫升离心管中；(5)在10,000×g下离心2分钟后小心吸取上清液0.4毫升到一洁净的2毫升离心管中，将吸附基质悬浮液(吸附基质悬浮液的制备0.3M HAc Buffer，7M KSCN，pH6左右，再加用稀硝酸洗涤和去离子水浸泡过夜并在80℃下烘干的硅藻土，使其终浓度为5％(克/毫升))摇匀后加1毫升；(6)手动轻轻摇匀2分钟，使DNA与吸附基质充分结合；(7)在10,000×g下离心10秒后小心弃去上清液0.8毫升，将吸附基质重新悬浮后全部吸取，移到含收集管的离心纯化柱(离心纯化柱购买自上海赛百盛基因技术有限公司)上；(8)在10,000×g下离心1分钟收集沉淀，倒去收集管中的废液；(9)在离心纯化柱上加0.5毫升洗涤液(洗涤液的制备12ml 3M NaAc与100ml乙醇混合后调pH值至7.0)，在10,000×g下离心1分钟洗涤基质，倒去收集管中的废液，再在10,000×g下离心2分钟以除去残留的洗涤液；(10)将离心纯化柱转至一洁净的1.5毫升离心管中，于室温下干燥2分钟；(11)在离心纯化柱中间加100微升TE缓冲液(TE缓冲液的制备10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0，121℃灭菌30分钟)或去离子水，用手指轻弹管壁1分钟以保证DNA的充分洗脱，在10,000×g下离心1分钟收集DNA；(12)以步骤(11)抽取的DNA为模板，以16S rDNA引物338F 5’CTCCTACGGGAGGCAGCAG3’，(Gentry，T.J.，Wang，G.，Rensing，C.and Pepper I.L.(2004).Chlorobenzoate-degrading bacteria in similar pristine soilsexhibit different community structures and population dynamics in response to anthropogenic 2-，3-，and4-chlorobenzoate levels.Microb.Ecology 48，90-102)和1492R 5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’(Wilson，K.H.，Blitchington，R.B.and Green，R.C.(1990)Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with polymerase chainreaction.Journal of.Clinical Microbiology 28，1942-1946)为引物扩增出土壤16S rDNA并进行电泳检测；(13)用EcoR I和Pst I对步骤(11)提取的DNA作双酶切并进行电泳检测。 附图说明 图1是用3种不同方法提取同一样品土壤总DNA的电泳检测图。图中编号1-3依次为直接法、试剂盒法和本专利技术方法提取的DNA，点样量均为10ul。DNA Marker I的分子量标准从上至下依次为15000bp，10000bp，7500bp，5000bp，2500bp，1000bp，250bp(bp碱基对，北京天为时代科技有限公司，目录号MD115-01)。 图2是用3种不同方法提取同一样品土壤总DNA做PCR扩增的产物电泳检测图。1-3依次为直接法、试剂盒法和本专利技术方法提取的DNA不稀释做模板，4-6依次为3种方法提取的DNA稀释10倍做模板，点样量均为10ul。DNA Marker II的分子量标准从上至下依次为1500bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp(bp碱基对，北京天为时代科技有限公司，目录号MD109-01)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种土壤总ＤＮＡ的小量快速提取方法，其主要步骤包括：样品制备、ＰＣＲ和电泳，具体步骤如下：（１）制作裂解管：称取石英沙和二氧化硅粉末各１０克，先用稀硝酸洗涤，然后用去离子水洗涤并浸泡过夜，再在８０℃下烘干，精确称取烘干的石英沙和二氧 化硅粉末各０．３克，装入２ｍｌ的离心管，１２１℃灭菌３０分钟；（２）称取土样０．５克到步骤（１）的裂解管中，加裂解缓冲液１毫升后混匀；（３）用胶带将裂解管固定在旋涡混合仪上振荡５分钟；（４）在１０，０００×ｇ下离心１ 分钟后将尽可能多的上清液转至一洁净的１．５毫升离心管中；（５）在１０，０００×ｇ下离心２分钟后小心吸取上清液０．４毫升到一洁净的２毫升离心管中，将吸附基质悬浮液摇匀后加１毫升；（６）手动轻轻摇匀２分钟，使ＤＮＡ与吸附基质充分 结合；（７）在１０，０００×ｇ下离心１０秒后小心弃去上清液０．８毫升，将吸附基质重新悬浮后全部吸取，移到含收集管的离心纯化柱上；（８）在１０，０００×ｇ下离心１分钟收集沉淀，倒去收集管中的废液；（９）在离心纯化柱上加 ０．５毫升洗涤液，在１０，０００×ｇ下离心１分钟洗涤基质，倒去收集管中的废液，再在１０，０００×ｇ下离心２分钟以除去残留的洗涤液；（１０）将离心纯化柱转至一洁净的１．５毫升离心管中，于室温下干燥２分钟；（１１）在离心纯化柱中 间加１００微升ＴＥ缓冲液或去离子水，用手指轻弹管壁１分钟以保证ＤＮＡ的充分洗脱，在１０，０００×ｇ下离心１分钟收集ＤＮＡ；（１２）以步骤（１１）抽取的ＤＮＡ为模板，以１６ＳｒＤＮＡ引物３３８Ｆ５’ＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣ ＡＧＣＡＧ３’和１４９２Ｒ５’ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ３’为引物扩增出土壤１６ＳｒＤＮＡ并进行电泳检测；（１３）用ＥｃｏＲＩ和ＰｓｔＩ对步骤（１１）提取的ＤＮＡ作双酶切并进行电泳检测。...

【技术特征摘要】
1.一种土壤总DNA的小量快速提取方法，其主要步骤包括样品制备、PCR和电泳，具体步骤如下(1)制作裂解管称取石英沙和二氧化硅粉末各10克，先用稀硝酸洗涤，然后用去离子水洗涤并浸泡过夜，再在80℃下烘干，精确称取烘干的石英沙和二氧化硅粉末各0.3克，装入2ml的离心管，121℃灭菌30分钟；(2)称取土样0.5克到步骤(1)的裂解管中，加裂解缓冲液1毫升后混匀；(3)用胶带将裂解管固定在旋涡混合仪上振荡5分钟；(4)在10,000×g下离心1分钟后将尽可能多的上清液转至一洁净的1.5毫升离心管中；(5)在10,000×g下离心2分钟后小心吸取上清液0.4毫升到一洁净的2毫升离心管中，将吸附基质悬浮液摇匀后加1毫升；(6)手动轻轻摇匀2分钟，使DNA与吸附基质充分结合；(7)在10,000×g下离心10秒后小心弃去上清液0.8毫升，将吸附基质重新悬浮后全部吸取，移到含收集管的离心纯化柱上；(8)在10,000×g下离心1分钟收集沉淀，倒去收集管中的废液；(9)在离心纯化柱上加0.5毫升洗涤液，在10,000×g下离心1分钟洗涤基质，倒去收集管中的废液，再在10,000×g下离心2分钟以除去残留的洗涤液；(10)将离心纯化柱转至一洁净的1.5毫升离心管中，于室温下干燥2分钟；(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王革娇，蔡林，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]