小报春诱变四倍体的方法及倍性早期鉴定技术技术

本发明专利技术涉及一种利用秋水仙素诱导小报春（Ｐｒｉｍｕｌａ　　ｆｏｒｂｅｓｉｉ）获得四倍体的方法。该方法是小报春种子用清水浸泡２４ｈ后，在黑暗条件下，利用浓度范围０．５～１．５ｇ／ｌ的秋水仙素溶液对小报春种子进行３６～４８ｈ的浸泡处理，控制温度２０±２℃。通过形态学及细胞学染色体等方法进行倍性早期鉴定方法本发明专利技术采用秋水仙素诱导小报春四倍体的方法，成功率较高，效果最佳，同时，四倍体小报春Ｆ↓［１］代植株可以保持其种性稳定遗传；与二倍体小报春比较，小报春四倍体变异植株表现出花朵增大，香味浓，花葶粗壮等优良性状特征，提高了观赏价值，实现了利用秋水仙素诱导小报春多倍体的方法，创造了新种质。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于诱变育种领域，具体地说本专利技术涉及小报春诱变四倍体的方法及倍性早期鉴定技术。
技术介绍
小报春(Primula forbesii)原产于我国云南、四川，是报春花科报春花属二年生植物，生于海拔1500～2800m的水沟边、田间、路边草坡，通常花序被粉；伞形花序1～2轮或多于2轮，每轮5～15花，花瓣5枚，花冠淡红或淡紫，裂片先端深凹陷，直径约1cm，自然花期12月～翌年3月(陈封怀和胡启明，1990)，染色体2n＝18。1891年，Vilmorin将小报春(Primula forbesii)引种到法国，但是现在欧洲园林中已很少看到(Richards，1993)。小报春(Primula forbesii)开花时正处于冬春少花季节，而且花期长，花型优雅，花香浓郁，是一种非常有开发价值的野生花卉，但由于自然植被的破坏和人类的过度开发，其分布范围日益缩小。2000年，北京林业大学与昆明黑龙潭公园合作开展小报春(Primula forbesii)的引种驯化研究，并在第八届梅花腊梅展中首次作为观花地被直接应用于园林；2002年，将小报春(Primula forbesii)从云南引种到北京，并对其生长、开花特性进行了初步研究，现在小报春在温室中能正常生长、开花，观赏价值比野生状态下有了很大的提高，花朵直径增加为1.4～1.8cm。报春花属植物多数原产于高山地区，引种驯化相对比较困难，小报春是目前国内报春花引种最为成功的少数几个种之一。这一成功奠定了进一步开展小报春(Primula forbesii)的多倍体育种、杂交育种、辐射育种以及分子育种的基础。近年来，课题组开始尝试通过化学诱导的手段来提高小报春的观赏性，其中包括秋水仙素处理。在常规的多倍体诱导方法中，秋水仙素诱导可以直接对种子进行处理，也可以对植物器官进行处理，通过组织培养的方式得到四倍体植株。在一系列的尝试中，通过以秋水仙素处理叶片、种子，结合组织培养的方式进行选择的方法没有成功，因为经过处理的器官受到较大伤害，在培养过程中往往死亡并且以叶片为外植体需要进行愈伤组织诱导，过程中的变异同样影响四倍体的鉴定。通过反复的研究，以合适浓度秋水仙素处理种子以获得多倍体的方法得到成功并可以应用于实践。目前为止，尚无利用秋水仙素诱导小报春(Primula forbesii)多倍体的技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用秋水仙素诱导小报春(Primulaforbesii)获得四倍体的方法，以提高小报春的观赏性，并为报春花属植物的育种研究提供方法参考。本专利技术的一种小报春诱变四倍体的方法，是把小报春种子用清水浸泡24h后，在黑暗条件下，利用浓度范围为0.5～1.5g/L的秋水仙素溶液对小报春种子进行36～48h的浸泡处理，控制温度20±2℃。优选的，秋水仙素的浓度为1.0g/L，处理时间为48h。本专利技术还提供了一种小报春诱变四倍体的倍性早期鉴定方法，该方法包括以下步骤(1)形态鉴定测量叶片的下表皮气孔大小，统计气孔内叶绿体粒数；测量花粉粒直径，相关形态指标在统计学意义上显著大于二倍体小报春的可初步判定为多倍体；(2)染色体鉴定选择形态初步鉴定认为是多倍体的小报春，于下午14:00～17:00小报春体细胞染色体中期分裂相对多时切取根尖，每一株挑选幼嫩根尖5～8个，用0.5g/L的秋水仙素和0.002mol/L的8-羟基喹啉体积比为1∶1的混合液，预处理2～3h，卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸＝3∶1)固定2～24小时，1N的HCL60℃水解10～12min，卡宝品红染色压片，OLYMPUS显微镜观察，染色体数目为2n＝36的鉴定为四倍体。本专利技术小报春诱变四倍体的方法及倍性早期鉴定技术与现有技术相比，具有以下优点和积极效果1、确定了采用秋水仙素诱导小报春(Primula forbesii)种子的方法，诱导成功率较高，效果最佳，为报春花属植物育种的研究提供了极优的参考方法。2、本专利技术成功地将形态学和细胞学方法综合应用在四倍体小报春变异的早期鉴定上，提高了诱变育种的效率和目的性，也为草本花卉育种提供了一套可借鉴的早期鉴定方法。3、成功得到了小报春四倍体变异植株，并表现出花朵增大，香味浓，花葶粗壮等优良性状特征，提高了观赏价值。4、秋水仙素诱导方法得到的四倍体相关形态特征能够稳定遗传，这一特点使得通过化学诱变手段进行报春花属植物育种的方法得到肯定，具有极大地指导意义。附图说明图1二倍体与四倍体小报春下表皮气孔比较(a)二倍体(b)四倍体图2二倍体和四倍体小报春花粉比较(a)二倍体长花柱花粉(b)二倍体短花柱花粉(c)四倍体长花柱花粉(d)四倍体短花柱花粉图3二倍体和四倍体小报春生物学和细胞学特征比较(a)二倍体小报春植株形态(b)四倍体小报春植株形态(c)四倍体叶片(左)与二倍体叶片(右)正面(d)四倍体叶片(左)与二倍体叶片(右)背面(e)二倍体的染色体形态(×1000)(f)四倍体染色体形态(×1000) 具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例11、秋水仙素诱导处理取一定量的小报春种子分30个组(处理)，分别置于1.5ml离心管中，清水浸泡24h，后用0.1g/L、0.2g/L、0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L和2.0g/L六个浓度梯度的秋水仙素1溶液分别浸泡12h、24h、36h、48h和72h，采用两因素随机区组试验设计。秋水仙素见光易分解，全部处理置于人工气候箱黑暗条件下，控制温度20±2℃。2、处理后种子的发芽小报春处理完毕后，清水冲洗3～4次，温室穴盘播种，以清水浸泡48h的种子做发芽对照和温室播种对照。随着秋水仙素浓度的增加和处理时间的延长，小报春种子发芽势，发芽率皆呈下降趋势，发芽时间也随着浓度和处理时间的增加延长，发芽不整齐。2个月时，统计秋水仙素各处理组合小报春的成苗率，0.1g/L处理24h，成苗率最高，达到62.7％，2.0g/L处理72h，成苗率最低，只有23.5％，都显著低于对照(93.7％)，对秋水仙素浓度单因子和处理时间单因子的分析，发现秋水仙素浓度为2.0g/L或处理时间是72h的成苗率显著低于其他四个浓度或其他三个时间处理。3、早期倍性鉴定小报春营养生长期，仔细观察植株的变异情况，标记那些有明显叶片加厚扭曲，颜色加深，表皮毛变长，叶脉变粗的植株，进行多倍体的初选。开花期，随机分别选取30株变异小报春和对照小报春测量相同节位叶片的下表皮气孔大小，统计气孔内叶绿体粒数；测量50朵变异植株和对照植株的花朵冠檐直径，并选择其中10朵花测花粉粒直径，相关形态指标在统计学意义上显著大于二倍体小报春的可初步判定为多倍体。同时，观察染色体数目，鉴定染色体倍性。选择形态鉴定初步认为是多倍体的小报春，于下午14:00～17:00小报春体细胞染色体中期分裂相对多时切取根尖，每一株挑选幼嫩根尖5～8个，0.5g/L的秋水仙素和0.002mol/L的8-羟基喹啉混合液(1∶1)预处理2～3h，卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸＝3∶1)固定2～24小时，1N的HCL60℃水解10～12min，卡宝品红染色压片，OLYMPUS显微镜观察。选择中期分裂相较好的30～40个细胞，统计染色体数目，分析染色体的倍性。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小报春诱变四倍体的方法，其特征在于，小报春种子用清水浸泡２４ｈ后，在黑暗条件下，利用浓度范围为０．５～１．５ｇ／Ｌ的秋水仙素溶液对小报春种子进行３６～４８ｈ的浸泡处理，控制温度２０±２℃。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张启翔，金晓霞，李翠娟，张艳丽，张小曼，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]