一种基于选择性探针的多重PCR方法及其应用技术

本发明专利技术涉及核酸扩增，具体涉及一种可同时扩增多个核酸片段的基于选择性探针的多重ＰＣＲ方法及其应用。本发明专利技术所述的多重ＰＣＲ方法包括以下步骤：（１）构建选择性探针；（２）延伸－连接反应；（３）ＰＣＲ扩增；（４）检测ＰＣＲ扩增产物。其关键特征是反应体系中使用了选择性探针，并且，ＰＣＲ扩增产物可存在长度的差异。该方法不但使分析通量大大提高，还可节省待检样本的核酸模板用量。与传统的使用多对引物的多重ＰＣＲ技术相比，本发明专利技术的方法仅使用一对通用引物，但在理论上可至少同时扩增上千个靶核酸序列，具有操作简便、通量大、检测系统兼容性高等显著优点。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种基于选择性探针的多重ＰＣＲ方法，其特征是，包括以下步骤：　　　　（１）构建选择性探针：　　　　选择性探针的５’－端和３’－端分别设置一个与靶双链核酸序列的同一条核酸单链序列的５’－和３’－端或者靶单链核酸序列的５’－端和３’－端互补的互补区，两个互补区的中间部分设置为两个通用序列区；通用序列区与互补区直接相连，或者通过标签序列相连接；两个通用序列区直接相连，或者中间设置一个尿嘧啶区，通过尿嘧啶区的尿嘧啶寡核苷酸相连；　　　　（２）延伸－连接反应：　　　　将下列物质混合，进行延伸－连接反应：　　　　①起始核酸模板；　　　　②步骤（１）所构建的选择性探针；　　　　③四种三磷酸脱氧核糖核苷酸，包括ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ和ｄＧＴＰ；　　　　④ＤＮＡ连接酶和ＤＮＡ聚合酶，及其相应的缓冲液体系；或者，逆转录酶和ＤＮＡ聚合酶，及其相应的缓冲液体系；　　　　（３）ＰＣＲ扩增：　　　　其中反应物包括：延伸－连接反应产物、与选择性探针的通用序列对应的一对通用引物、四种三磷酸脱氧核糖核苷酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ和ｄＧＴＰ）、ＤＮＡ聚合酶及其相应的缓冲液体系；所述的一对通用引物，其中，一条通用引物与选择性探针的一个通用序列区的序列相同，另一条通用引物则与选择性探针另一个通用序列区的序列互补；　　　　（４）检测ＰＣＲ扩增产物，以确定待检样本中是否存在靶核酸和／或靶核酸的拷贝数。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄庆，府伟灵，王珏，黄君富，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]