编码代谢途径蛋白的谷氨酸棒杆菌基因制造技术

本发明专利技术涉及编码代谢途径蛋白的谷氨酸棒杆菌基因。描述了分离的编码新的谷氨酸棒杆菌ＭＰ蛋白的核酸分子，该分子被称为ＭＰ核酸分子。本发明专利技术也提供了反义核酸分子，含有ＭＰ核酸分子的重组表达载体，以及已导入表达载体的宿主细胞。本发明专利技术也进一步提供了分离的ＭＰ蛋白，ＭＰ突变蛋白，融合蛋白质，抗原肽，以及基于谷氨酸棒杆菌ＭＰ基因遗传工程提高由该生物体进行的所需化合物生产的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本明涉及编码代谢途径蛋白的谷氨酸棒杆菌基因。描述了分离的编码新的谷氨酸棒杆菌MP蛋白的核酸分子，该分子被称为MP核酸分子。本专利技术也提供了反义核酸分子，含有MP核酸分子的重组表达载体，以及已导入表达载体的宿主细胞。本专利技术也进一步提供了分离的MP蛋白，MP突变蛋白，融合蛋白质，抗原肽，以及基于谷氨酸棒杆菌MP基因遗传工程提高由该生物体进行的所需化合物生产的方法。
技术介绍
细胞中天然存在的代谢过程中的特定产物和副产物，在很多行业中具有用途，包括食品、饲料、化妆品和制药产业。这些分子总称为“精细化学物质”，包括有机酸、蛋白源的和非蛋白源的氨基酸、核苷酸和核苷、脂质和脂肪酸、二醇、糖类、芳香族化合物、维生素和辅因子以及酶。可以通过大规模培养产生并分泌大量特定所需分子的细菌，最方便的制备这些产品。用于这一目的的一种特别有用的生物体就是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，一种革兰氏阳性非病原菌。通过菌株筛选，出现了许多产生大批所需化合物的突变株。然而，为改进特殊分子生产而进行的菌株筛选，是一个耗时并且困难的过程。
技术实现思路
本专利技术提供了新的细菌核酸分子，这些分子具有多种用途。这些用途包括鉴定可以产生精细化学物质的微生物、调节谷氨酸棒杆菌或者亲缘细菌中的精细化学物质的产生、谷氨酸棒杆菌或者亲缘细菌的分型和鉴定、作为绘制谷氨酸棒杆菌基因组图谱的参照点。这些新的核酸分子编码蛋白质，此处称为代谢途径(MP)蛋白质。 谷氨酸棒杆菌是一种革兰氏阳性需氧细菌，通常在工业中被用于大规模生产各种精细化学物质，也用于降解烃类(例如在石油泄漏中)和氧化萜品醇。因此，本专利技术的MP核酸分子，可用来鉴定能用于生产精细化学物质的微生物，例如通过发酵方法。调节本专利技术MP核酸分子的表达，或者修饰本专利技术MP核酸分子的序列，可以用于调节微生物中一种或者多种精细化学物质的生产(例如，提高棒杆菌或者短杆菌中一种或者多种精细化学物质的产生)。 本专利技术MP核酸分子可用于鉴定一种微生物是否是谷氨酸棒杆菌或者其亲缘菌株，或者鉴定微生物混合群体中谷氨酸棒杆菌或者其亲缘菌株的存在。本专利技术提供了许多谷氨酸棒杆菌基因的核酸序列；在严格条件下，用探针探查从单一微生物或者混合微生物群体培养物中提取的基因组DNA，该探针覆盖了谷氨酸棒杆菌基因特有的一段区域，可以确定是否有该微生物存在。尽管谷氨酸棒杆菌本身是非病原性的，但是它与人体中的病原菌种有关，例如白喉棒状菌(Corynebacterium diphtheriae)(白喉致病原)；探测这种微生物具有重大的临床实用性。 本专利技术MP核酸分子也可以用作绘制谷氨酸棒杆菌基因组图谱的参照点，或者绘制其亲缘菌株基因组图谱的参照点。相似的，这些分子，或者其变体或其部分，可以用作遗传工程棒杆菌或者短杆菌的遗传标记。例如，本专利技术新核酸分子编码的MP蛋白可以进行某些精细化学物质代谢中的酶促步骤，所述精细化学物质包括氨基酸、维生素、辅因子、营养因子(nutraceutical)、核苷酸、核苷和海藻糖。考虑到可在谷氨酸棒杆菌中使用的克隆载体的实用性，例如在Sinkey et al.，美国专利号No.4,649,119中公开的，并且考虑到谷氨酸棒杆菌和亲缘短杆菌菌种(例如乳发酵短杆菌)的遗传操作技术(Yahihama et al，J.Bacteriol.162591-597(1985)；Katsumata et al.，J.Bacteriol.159306-311(1984)；以及Santamaria et al.，J.Gen.Microbiol.1302237-2246(1984))，本专利技术的核酸分子可用于该生物体的遗传工程，使之成为一种或者多种精细化学物质更好的或者更有效的生产者。 精细化学物质的提高或有效生产可以是本专利技术基因操作的直接作用或这种基因操作的间接作用。具体而言，谷氨酸棒杆菌氨基酸、维生素、辅因子、核苷酸和海藻糖代谢途径的改变对这种生物生产一种或多种这些所需化合物具有直接的效应。例如，优化赖氨酸生物合成途径蛋白活性或降低赖氨酸分解途径蛋白活性可以导致由这种工程改造的生物生产赖氨酸的产量或效率提高。这些代谢途径蛋白的改变也会对所需精细化学物质生产或效率有间接影响。例如，与生产所需分子必须的中间体竞争的反应可以被消除，或者生产所需化合物特定中间体必须的途径可以被优化。此外，氨基酸、维生素或核苷酸生物合成或降解的调控可以增加生产和分裂的能力，从而增加培养物中微生物的数量和/或生产能力，并增加所需精细化学物质的可能产量。 本专利技术的核酸和蛋白分子可以用来直接提高谷氨酸棒杆菌中一种或多种所需精细化学物质的生产或生产效率。使用本领域已知的重组技术，一种或多种本专利技术的氨基酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖的生物合成或降解酶可以被改变，从而调节其功能。例如，可以提高生物合成酶的效率，或破坏其别构控制区从而防止化合物生产的反馈抑制。类似地，降解酶可以通过置换、缺失或增加被缺失或修饰，从而其对所需化合物的降解活性降低，而不影响细胞的活力。在各种情况下，所需精细化学物质的总产量或产率均被提高。 本专利技术的蛋白质和核苷酸分子的改变也可能通过间接机制提高除氨基酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷或海藻糖以外的其它精细化学物质的生产。任一种化合物的代谢必然与细胞内其它生物合成和降解途径关联，一种途径中的必需辅因子、中间体或底物可能由其它同类途径供给或受其限制。因此，通过调整一种或多种本专利技术蛋白的活性，另一种精细化学物质生物合成或降解途径活性的生产或效率可能会受到影响。例如，氨基酸可以作为所有蛋白质的结构单元，但其在细胞内的存在的水平可能会限制蛋白合成；因此，通过增加细胞内一种或多种氨基酸的生产效率或产率，诸如生物合成或降解蛋白的蛋白可以更容易合成。同样，代谢途径酶的改变使得特定副反应更有利或不利时，会导致一种或多种用作生产所需精细化学物质的中间体或底物的化合物过量生产或生产不足。 本专利技术提供了新的编码蛋白质的核酸分子，这种蛋白质在此处称作代谢途径(MP)蛋白质，它们能够完成对细胞正常功能重要的分子例如氨基酸、维生素、辅因子、核苷酸和核苷酸或海藻糖代谢过程中的酶促步骤。编码MP蛋白的核酸分子此处称为MP核酸分子。在优选实施方案中，MP蛋白执行与以下一种或多种物质的代谢相关的酶促步骤氨基酸、维生素、辅因子、营养因子、核苷酸、核苷和海藻糖。这些蛋白质的实例，包括那些在表1中列出的基因所编码的蛋白质。 因此，本专利技术的一个方面涉及，分离含有一段编码一种MP蛋白或者其生物活性部分的核酸序列的核酸分子(例如，cDNA，DNA，或者RNA)，以及分离适合作为探测或扩增MP编码核酸(例如DNA或者RNA)的引物或者杂交探针的核酸片段。在特别优选的实施方案中，分离的核酸分子包含一段列在序列表中的序列号为奇数的核酸序列(例如，SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7...)或者一条这种核苷酸序列的编码区域或者其互补序列。在其他特别优选的实施方案中，分离的本专利技术核酸分子包含与序列表中的序列号为奇数的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO1，SEQ ID N本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的核酸分子或其互补序列，该核酸分子包含选自ＳＥＱＩＤＮＯ：１－１１５５的每个以奇数序列号列出的核酸序列条件是该核酸分子不由表１中列出的任何Ｆ－标明的基因组成。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M波姆佩朱斯，B克雷格尔，H施雷德，O策尔德，G哈贝豪尔，
申请(专利权)人：BASF公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]