基于ｄＵ或ｄＩ寡核苷酸探针的单核苷酸多态性检测方法技术

本发明专利技术涉及一种基于ｄＵ或ｄＩ寡核苷酸探针的单核苷酸多态性检测方法。ｄＵ或ｄＩ寡核苷酸探针序列特征是：全长３０－４０个核苷酸，５’端第１５－２５位的一个核苷酸与待检ＳＮＰ位点配对，３’端第１－１５位的一个核苷酸为ｄＵ或ｄＩ，ｄＵ或ｄＩ距离待检ＳＮＰ位点５－１５个核苷酸，整条寡核苷酸探针与待检ＳＮＰ位点及其两侧核苷酸配对。反应组份包括ｄＵ或ｄＩ寡核苷酸探针，待测单链ＤＮＡ，热稳定性ｍｕｔＳ蛋白，报告ＤＮＡ模板分子、报告ＤＮＡ特异性的引物，ｄＮＴＰｓ，ｐｆｕＤＮＡ聚合酶及其反应缓冲液。ｄＵ或ｄＩ寡核苷酸探针与待测单链ＤＮＡ杂交后，若ＳＮＰ位点处形成错配碱基，则ＰＣＲ可扩增出报告ＤＮＡ，若ＳＮＰ位点处形成正确配对碱基，则不能扩增出报告ＤＮＡ。根据报告ＤＮＡ扩增结果，可推定待测ＳＮＰ位点碱基种类。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种基于ｄＵ或ｄＩ寡核苷酸探针的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于包括以下步骤：１）设计合成测定单核苷酸多态性的ｄＵ或ｄＩ寡核苷酸探针，ｄＵ或ｄＩ寡核苷酸探针的序列特征是：探针全长３０－４０个核苷酸，５’端第１５－２５位的一个核苷酸与待测单链ＤＮＡ的待检单核苷酸多态性位点配对，３’端第１－１５位的一个核苷酸为ｄＵ或ｄＩ核苷酸，ｄＵ或ｄＩ核苷酸距离待检单核苷酸多态性位点５－１５个核苷酸，整条寡核苷酸探针与待测单链ＤＮＡ的ＳＮＰ位点及其两侧核苷酸配对；２）设计合成用于扩增报告ＤＮＡ的特异性正向引物和反向引物，引物的序列特征是：整条引物与报告ＤＮＡ模板分子中报告ＤＮＡ两端的碱基序列配对；３）采用热稳定性ＤＮＡ聚合酶催化的聚合酶链式反应扩增双链ＤＮＡ，聚合酶链式反应体系组成：热稳定性ＤＮＡ聚合酶反应缓冲液、待测单链ＤＮＡ模板分子、待测单链ＤＮＡ特异性引物、ｄＮＴＰｓ和热稳定性ＤＮＡ聚合酶，其中待测单链ＤＮＡ特异性引物中的一条采用５’端生物素标记；扩增双链ＤＮＡ后，将双链ＤＮＡ变性，与采用链亲和素包被的磁珠温育，在变性条件下洗涤磁珠，再用生物素溶液洗脱结合在磁珠上的待测单链ＤＮＡ；４）在ｐｆｕＤＮＡ聚合酶催化的聚合酶链式反应缓冲液中，加入待测单链ＤＮＡ、ｄＵ或ｄＩ寡核苷酸探针、热稳定性ｍｕｔＳ蛋白、报告ＤＮＡ特异性的正向引物与反向引物、报告ＤＮＡ模板分子、ｄＮＴＰｓ和ｐｆｕＤＮＡ聚合酶，配制单核苷酸多态性测定反应混合物；５）将单核苷酸多态性测定反应混合物进行聚合酶链式反应，扩增报告ＤＮＡ，测定待测单链ＤＮＡ待测位点的单核苷酸多态性；６）将聚合酶链式反应后的混合物置于质量浓度为１．５％的琼脂糖凝胶中，水平电泳检测报告ＤＮＡ扩增结果；若加入的ｄＵ或ｄＩ寡核苷酸探针与待测单链ＤＮＡ在单核苷酸多态性位点处正确配对，则扩增不出报告ＤＮＡ；若加入的ｄＵ或ｄＩ寡核苷酸探针与待测单链ＤＮＡ在单核苷酸多态性位点为错配碱基，则可以扩增出报告ＤＮＡ；根据报告ＤＮＡ扩增结果，推定待测单链ＤＮＡ待测位点单核苷酸多态性。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘喜朋，刘建华，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]