同时检测结核分枝杆菌复合体和鉴定其药物抗性的方法及所用材料技术

本发明专利技术涉及分子生物学、微生物学、和医学，并且提供在区分性生物芯片上在临床样品中检测结核分枝杆菌复合体并同时评价菌株对利福平和异烟肼的敏感性的方法。该方法基于２步多重ＰＣＲ来获得荧光ＤＮＡ片段，然后让这些片段在包含特异的区别性寡核苷酸组的微阵列上杂交。通过评价在微生物ＤＮＡ中的点核苷酸取代来确定结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的抗性。本发明专利技术允许直接分析临床样品，以便能同时评价大量突变，从而降低分析成本，减少实施时间。本发明专利技术还涉及用于实现该方法的引物组、生物芯片、和寡核苷酸探针组。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种用于在临床样品中同时检测结核分枝杆菌复合体和鉴定导致微生物对利福平和异烟肼产生抗性的分枝杆菌ＤＮＡ突变的方法，其包括：（Ａ）－使用一组用于第一ＰＣＲ步骤的特异性引物对，多重扩增ｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ、ａｈｐＣ基因、ＩＳ６１１０可动因子的片段；（Ｂ）－使用在步骤（Ａ）中获得的ＰＣＲ产物作为模板、和一组用于第二ＰＣＲ步骤的特异性引物对来多重扩增ｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ、ａｈｐＣ基因、ＩＳ６１１０可动因子的片段，其中每对引物中有一个引物被荧光标记以获得主要是单链荧光标记的片段；（Ｃ）－制备能够同时检测结核分枝杆菌复合体和鉴定导致对利福平和异烟肼产生抗性的突变的生物芯片，所述生物芯片由具有胶垫的基质组成，每个垫中固定有独特的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸的序列选自如下序列：ａ）与野生型ｒｐｏＢ基因片段序列相应的序列；ｂ）与导致微生物对利福平产生抗性的突变型变体ｒｐｏＢ基因片段序列相应的序列；ｃ）与ａ）和ｂ）中描述的序列互补的序列；ｄ）与野生型ｋａｔＧ基因片段序列相应的序列；ｅ）与导致微生物对异烟肼产生抗性的突变型变体ｋａｔＧ基因片段序列相应的序列；ｆ）与ｄ）和ｅ）中描述的序列互补的序列；ｇ）与野生型ｉｎｈＡ基因片段序列相应的序列；ｈ）与导致微生物对异烟肼产生抗性的突变型变体ｉｎｈＡ基因片段序列相应的序列；ｉ）与ｇ）和ｈ）中描述的序列互补的序列；ｊ）与野生型ａｈｐＣ基因片段序列相应的序列；ｋ）与导致微生物对异烟肼产生抗性的突变型变体ａｈｐＣ基因片段序列相应的序列；１）与ｊ）和ｋ）中描述的序列互补的序列；ｍ）与可动因子ＩＳ６１１０的序列相应的序列；ｏ）与描述于ｍ）中的序列互补的序列；（Ｄ）－在能为杂交时形成的区配和错配的双链体之间提供一个核苷酸的分辨率的条件下，在生物芯片上让在步骤（Ｂ）中获得的扩增出的标记产物杂交；（Ｅ）－记录和解析杂交数据。...

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：AS加塞达特勒夫，AY索博勒夫，DA格亚杜诺夫，SA拉帕，VM米卡伊洛维奇，AD米尔加贝科夫，
申请(专利权)人：俄罗斯科学院VA恩格尔哈特分子生物学研究所，
类型：发明
国别省市：RU[俄罗斯]