本发明专利技术涉及通用方案和构象敏感凝胶电泳筛查单核苷酸多态性位点法，该方法首先利用通用引物方案对目的核酸序列区段进行ＰＣＲ扩增，再应用Ｆ－ＣＳＧＥ技术进行高通量快速检测，最后通过ＤＮＡ测序技术对筛查出的位点进行最终确证。与其他检测方法比较，本发明专利技术方法通量更高，检测速度更快，成本更低，可用于检测未知ＳＮＰ和致病基因的单碱基突变，用于未知单碱基多态性、基因突变、单碱基插入或缺失等单碱基改变的筛查和确认。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属临床个体基因型的测定方法，特别是涉及一种通用方案和构象敏感凝胶电泳 筛查新单核苷酸多态性位点法。技术背景单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)作为第三代具有高度稳定性 的遗传标记遗传标记，在基因定位、克隆、遗传多态性方面具有广泛应用，特别是作为基 因诊断标记在预防医学中具有十分重要的作用，可以作为进行疾病诊断、预防和药物筛选 的基础。目前筛选SNP和未知突变的主要方法有单链构象多态性检测(single-strand conformation polymorphism analysis, SSCP)Orita M， Iwahana H， Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T.. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. Prac. AW/. Jcfld Sd. C75^, 1989, 86(8): 2766-2770，变性梯度 凝胶电泳(denaturing gel gradient electrophoresis, DGGE) Fischer, S.G" Lerman, L.S. DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels: correspondence with melting theory. iVoc. A^/. ^ca^. /7&i 1983， 80(6): 1579-1583，变性 高效液相色谱技术(DHPLC)Underhill PA, Jin L, Lin AA, Mehdi SQ, Jenkins T， Vollrath D， Davis RW, Cavalli-Sforza IX, Oefner PJ.. Detection of numerous Y chromosome biallelic polymorphisms by denaturing high-performance liquid chromatography. i es， 1997,7(10): 996-1005，直接测序法等。这些方法在某种程度上均能完成对SNP的检测，但应用 上也有些不足。SSCP影响因素很多，如电泳温度、胶中甘油浓度及胶浓度等均可影响检测 的灵敏度，并且检测单碱基替换的敏感性较弱。DHPLC对试剂和环境要求较高。DGGE技 术检测片段大于500bp，长度上优于其它方法，几乎可达100%的有效检测率，无需放射标 记，但是当SNP发生在高熔点区时则难以利用DGGE技术检测。而对于一些比较小、外显 子相对较少的基因的SNP可直接测序，其检测效率可以达到100%，但对于较大的外显子相 对较多的基因，直接测序的成本较高。最近发展的荧光-构象敏感凝胶电泳法 (fluorescence-based conformation sensitive gel electrophoresis, F-CSGE)步骤简单快速，高 通量、低成本、可利用现有试验条件，无需添加新设备，可检测较长片段( 250-500bp)Leung YF, Tarn PO, Tong WC, Baum L, Choy KW， Lam DS, Pang CP. High-throughput conformation-sensitive gel electrophoresis for discovery of SNPs. 5z'ofcc/w/《way, 2001,30(2):334-335, 338-340。由于该方法建立的基础为单碱基错配，所以在单碱基突变检测中，与SSCP检测碱基替换较弱的敏感性(仅单链构象差异)相比，该方法具有更加明显 的高敏感性。这也是CSGE技术用于SNP筛查的优势。但是，因为F-CSGE技术依赖荧光PCR 过程，对每一对引物标记荧光成本较高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用通用方案和构象敏感凝胶电泳技术筛査SNP位点的方 法。该法通量更高、检测速度更快、成本更低地筛查人类或其他动物基因组中未知SNP的 方法，可用于未知单碱基多态性、基因突变、单碱基插入或缺失等单碱基改变的筛查和确 认，作为基因诊断标记应用于疾病诊断、预防和药物筛选。本专利技术的通用方案和构象敏感凝胶电泳筛査单核苷酸多态性位点法，包括下列步骤(1) 样本预处理 采用试剂盒抽提测试者全血或组织基因组DNA;(2) PCR反应设计1对通用荧光引物(universal primer)，根据样本靶序列设计N对(1~10)特异性 附加通用荧光序列的非荧光引物(specificprimers),通用引物标记HEX荧光，特异性引物 无需添加荧光标记，通用引物和特异性引物于同一PCR体系里进行反应；(3) 构建异源双链在总体样本中随机选取样本A作为对照样本，其余样本PCR产物分别与A样本PCR 产物混合后，利用6步梯度逐次降温法于PCR扩增仪构建异源双链:98°C 5 min; 98°C—90 °C 5 min; 90°C—80 °C 5 min; 80°C—75 。C 10 min; 75°C—60 °C 10 min; 60°C—40 °C 20 min; 40°C—25 °C 20min，反应完成后半小时内电泳上样；(4) 配制构象敏感凝胶电泳(CSGE)温和变性胶并荧光-构象敏感凝胶电泳法(F-CSGE) 检测SNPs;(5) 根据电泳峰型图分析判断SNP状态；(6) DNA测序在经F-CSGE发现SNP信号后，用DNA直接测序确定具体的变异类型。 所述通用荧光引物是上游引物5'-TCACTTGCTTCCGTTGAGG-3'，下游引物5，-GGTTTCGGATGTTACAGCGT-3 ，。所述步骤(2)中用HEX荧光染料标记PCR通用引物5'端。所述步骤(2)中的PCR方法为通用引物PCR法。所述步骤(4)中的配制CSGE温和变性胶步骤 ①配制50x聚丙烯酰胺母液(99: 1)200810034460.0说明书第3/6页49.5 g丙烯酰胺(Acrylamide)， 0.5 g双丙烯酰胺(Bis-Acrylamide, BAP)，加双蒸水 至100 ml;② 配制10%聚丙烯酰胺胶50 ml 50x聚丙烯酰胺胶母液，37.5 ml甲酰胺(15%)， 25 ml 10xTris-硼酸缓冲液(TBE), 加137.5 ml双蒸水，总体系250 ml;③ 胶体聚合25 ml 10%聚丙烯酰胺胶，250 pL 10%过硫酸铵，13.5 pL四甲基乙二胺(TEMED)， 2 小时凝固；所述步骤(4)中的电泳法步骤① 377测序仪电泳环境2kv， 4hr， 30°C， lxTBE;② 混样0.5nLPCR产物，0.5pLROX (荧光染料)，0.5 pL葡聚糖蓝(50mg/ml)， 0.5^1新鲜的去离子甲酰胺；③ 上样毛细管吸取1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通用方案和构象敏感凝胶电泳筛查单核苷酸多态性ＳＮＰ位点法，包括下列步骤：（１）样本预处理采用试剂盒抽提测试者全血或组织基因组ＤＮＡ；（２）ＰＣＲ反应设计一对通用荧光引物，根据样本靶序列设计Ｎ对特异性附加通用荧光序列的非荧光引物，通用引物标记ＨＥＸ荧光，特异性引物无需添加荧光标记，通用引物和特异性引物于同一ＰＣＲ体系里进行反应；（３）构建异源双链选取样本Ａ作为对照样本，其余样本ＰＣＲ产物分别与Ａ样本ＰＣＲ产物混合后，利用６步梯度逐次降温法于ＰＣＲ扩增仪构建异源双链；（４）配制构象敏感凝胶电泳ＣＳＧＥ温和变性胶与荧光－构象敏感凝胶电泳法Ｆ－ＣＳＧＥ检测ＳＮＰｓ；（５）根据电泳峰型图分析判断ＳＮＰ状态；（６）ＤＮＡ测序：在经Ｆ－ＣＳＧＥ发现ＳＮＰ信号后，用ＤＮＡ直接测序确定具体的变异类型。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：范忠鹏，朱旺升，于明辉，周宇荀，李凯，肖君华，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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