在磁性支持物上采用加热分离核酸的方法技术

本发明专利技术涉及在磁性支持物上采用加热分离核酸的方法。其目的在于提供一种不需要使用严酷的化学药品而从含有细胞的样品中迅速且有效地破坏细胞，从而简便地分离出核酸的方法。即，提供了一种从含有细胞的样品中分离核酸的方法，还提供了一种实施本发明专利技术的核酸分离用的试剂盒，以及该试剂盒中含有的核酸分离用的器具以及装置。从含细胞样品中分离核酸的方法包括将样品中含有的细胞结合在磁性支持物上，随后将该磁性支持物与样品液进行固液分离，在８０－１２０℃加热２０－３００秒，破坏结合在该磁性支持物上的细胞的细胞膜，回收由此游离出的核酸的步骤。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从含有细胞的样品中分离核酸的方法等。更具体地，涉及一 种通过加热破坏附着在磁性支持物上的细胞并分离释放出的核酸的方法以 及用于实施该方法的试剂盒、装置等。
技术介绍
近来，作为样品或材料的核酸的用途已扩大到科学研究、医疗、工业界 等各个领域中，因此要求得到 一种高效率的且得率高的可从多种样品中提取 并分离核酸的方法。以前使用苯酚'氯仿提取法作为从含有细胞的试样中获得核酸的方法。这 种古典的方法是用苯酚V氯仿使蛋白质、脂质等难溶于水的受检成分发生变 性、溶解或沉淀，利用核酸在水相中溶解所谓的溶解度的不同进行分离。最 近提出了各种不使用有毒溶剂的替代方法。已经公开了 一种采用将分枝杆菌暴露在对于溶菌有效的热量下而不是 用溶菌剂及其他为了溶菌的条件(机械方法)进行溶菌，从而得到菌核酸的方法(参见美国专利第5376527号)。在末梢血单核细胞的水性试样的情况下还 可通过加热使细胞溶解(参见美国专利第5334499号)。还提出了一种分离核酸的方法，其将细胞结合在磁性支持物上，加入表 面活性剂和/或离液(力才卜口一y)试剂与其作用，使游离出来的核酸结合在 相同的磁性支持物上(参见国际公开W098/51693)。此外，还乂>开了使核酸 自动分离出的优选的方法，其是将试样结合在固体载体上，在其中使用细胞 溶解液(Gentra Systems社)，使核酸游离出并将其分离的方法(参见国际公开 W099/13976)。这种方法还含有为了促进核酸从固体载体中溶出而使用的辅 助性的加热步骤。此外，还已知一种提取分离核酸的方法，其利用涂布了含有核酸的试样 的加工材料的压碎分散作用(基于超声波的振动及上下运动)引起的破碎及粉碎，从而游离出核酸，将这些核酸结合在作为核酸提取载体的磁性支持物上， 利用已经磁化了的该加工材料和磁性支持物的磁性作用，高效率地提取分离核酸(参见特开2004-337137号)。虽然记载了使用离液序列高的(力才卜口匕° 夕)物质或乙醇作为洗净液的内容，但是其没有公开核酸的提取溶液的详 细情况。将通过上述方法用有机溶剂、离液试剂、溶菌剂或表面活性剂提取出的 核酸用作聚合酶链锁反应(Polymerase Chain Reaction) 、 SDA(Strand Displacement Amplification) 、 LCR(Ligase Chain Reaction) 、 gap LCR 、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) 、 TMA(Transcription-Mediated Amplification) 、 QPReplicase Amplification、 TAS(Transcription Amplification System)、 3SR(Self-Sustained Sequence Replication System)、 NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)等DNA扩增法的模板或用限制酶消化的 情况中，核酸溶液中残存的药剂将成为阻碍，并且将其除去的方法非常复杂。尤其是在提取微量样品时这些提取方法并不适用。美国专利第5763185号及美国专利号第6210881号中记载了除去核酸杂 交干扰物质的方法。换句话说，该方法包括使干扰性物质溶化，让具有不会 从细胞中释放出核酸的作用的物质与该细胞接触的步骤，以及，采用离心分 离从该作用物质中分离出细胞的步骤。如上所述，现在还没有一种方法在不采用有毒溶剂或腐蚀性试剂的情况 下可从来源于生物的含有各种各样的核酸的试样中，简便且迅速地提取精制 得到高纯度核酸，并且还可自动化操作。因此迫切希望提出这样一种方法。与之相关的，美国专利第5554503号中提出了一种核酸分离方法，其通 过离心分离唾液(最小4000xG、至少5分钟)，洗净颗粒，离心分离(至少 12000xG)后，在95-120。C加热5-30分钟，石皮坏细月包膜来分离核酸。此外国 际乂>开号WO01/053525中记载了 一种核酸分离方法，其通过将细胞结合在 固体载体的非特异的配基上，溶解结合的细胞，将释放出的核酸结合在固体 载体上来分离核酸。
技术实现思路
鉴于上述情况，本专利技术人通过深入研究的结杲发现，将样品中的细胞合在磁性支持物上，加热处理使细胞膜破坏，可得到核酸，由此完成了本发 明。依据本专利技术的方法，还提供了从受检物中简便地分离出高纯度核酸的试 剂盒。本专利技术的 一方面是从含有细胞的样品中分离核酸的方法，其通过使用可装卸的带有覆盖物的磁铁以及配置在一个工作台上的以下容器(1) 用于混合含有细胞的样品与使细胞附着于其上的磁珠的容器1、(2) 用于洗净附着了细胞的磁珠的洗净槽，以及(3) 用于加热处理洗净后的^f兹珠的容器2， 进行将含有细胞的样品中的细胞附着在磁珠上、洗净、直至从细胞中分离出核酸的过程，该过程包括在容器1内混合含有细胞的样品液与磁珠的 步骤；将磁珠从容器1中取出洗净的步骤；随后将该磁珠在容器2内悬浮在再悬浮緩冲液中，将该容器2在 80-120。C时加热20-300秒的步骤； 整个过程在600秒以内完成。附图说明图1示出了本专利技术方法的操作步骤的概要。图2示出了使用磁珠及具有覆盖物的磁铁的核酸分离试剂盒中的操作概 念图。本文中将分别说明步骤(l)-(7)的内容。图3示出了使用磁珠的核酸分离器具中的各容器的典型例子。cj)表示(圓 的)直径，R表示(圆的)半径，SR表示球的半径。在容器1的底部标出的R2 表示内侧壁形成为半径2mm的圆，R4表示外侧壁形成半径为4mm的圆。 容器2的底部标出的SR5.75、 SR7.25具有相同的意思。图4示出了核酸分离器具中磁铁覆盖体的一种情况。各记号c])、 R、 SR 表示的意思与图3相同。底部标出的SR4.1、 SR5.5与图3的说明相同。在 示出了向容器1中插入磁铁覆盖体的状态的图(下面的图)中，4.4表示在装入 样品lmL的情况中的液面高度，0.35表示在将磁铁及磁铁覆盖物插入容器1 时液面上升的高度。图5(a)是示出核酸分离器具中水平移动装置的示意图；图5(b)是示出旋 转移动装置的示意图。图6是示出图5(b)的旋转移动装置的移动模式图。图7是装入用于实施本专利技术基因检测法的核酸分析装置中的微芯片的模 式图。具体实施方式 核酸分离方法本专利技术是从含有细胞的样品中分离核酸的方法，其特征在于通过使用可装卸的带有覆盖物的磁铁以及配置在一个工作台上的以下容器(l)用于混合 含有细胞的样品与使细胞附着于其上的磁珠的容器1、(2) 用于洗净附着了细胞的磁珠的洗净槽，以及(3) 用于加热处理洗净后的/f兹珠的容器2，进行将含有细胞的样品中的细胞附着在磁珠上、洗净、直至从细胞中分 离出核酸的过程，该过程包括在容器1内混合含有细胞的样品液与磁珠的 步骤；将磁珠从容器1中取出洗净的步骤；随后在容器2内将该磁珠悬浮在再悬浮緩沖液中，将该容器2在 80-120。C下加热20-300秒的步骤； 整个过程在600秒内完成。本专利技术的方法为将样品液中含有的细胞吸附、附着或结合(在本说明书 中任一场合有时也仅仅用"附着"表示)在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从含有细胞的样品中分离核酸的方法，该方法通过使用可装卸的带有覆盖物的磁铁以及配置在一个工作台上的以下容器：（１）用于混合含有细胞的样品与能使细胞附着于其上的磁珠的容器１、（２）用于洗净附着了细胞的磁珠的洗净槽、以及（３）用于加热处理洗净后的磁珠的容器２，进行将含有细胞的样品中的细胞附着在磁珠上、洗净、直至从细胞中分离出核酸的过程，该过程包括：在容器１内混合含有细胞的样品液与磁珠的步骤；从容器１中取出该磁珠，进行洗净的步骤；随后将该磁珠在容器２内悬浮于再悬浮缓冲液中，将容器２在８０－１２０℃加热２０－３００秒的步骤；其中，整个过程在６００秒以内完成。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：宫崎幸司，中岛彰久，碓井圭名子，日野文嗣，向井博之，加藤郁之进，
申请(专利权)人：柯尼卡美能达医疗印刷器材株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]