提取用于转基因植物成分检测的饲料DNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种提取用于转基因植物成分检测的饲料ＤＮＡ的方法。该方法，包括：１）将饲料加入提取液中混匀，加入β－巯基乙醇至终浓度为０．２％，于６５℃提取，离心得到上清液；２）将上清液加入是所述上清液１倍体积的异丙醇混匀，－２０℃静置１５ｍｉｎ，然后离心得到初步ＤＮＡ沉淀；３）将ＤＮＡ沉淀后，用ＲＮＡ酶消化；４）将步骤３）得到的ＲＮＡ酶消化后的ＤＮＡ溶液依次用Ｔｒｉｓ饱和酚，Ｔｒｉｓ饱和酚、氯仿和异戊醇的体积比２５∶２４∶１的混合液，氯仿与异戊醇的体积比为２４∶１的混合液抽提得到饲料ＤＮＡ溶液。该方法提取饲料ＤＮＡ，能除去饲料中蛋白、酚和糖类杂质的干扰，得到高质量的ＤＮＡ产物，可直接用于ＰＣＲ方法定性检测饲料中的转基因成分。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种提取用于转基因植物成分检测的词料DNA的方法。
技术介绍
随着我国人民生活水平的提高和全面进入小康社会，人们对畜产品的安全、质量 要求越来越高。所以，为获得高质量的畜产品，我们政府从农业生产中的饲料届和养 殖届中寻求可持续发展途径。饲料安全是指饲料生产必须对动物健康和生长、人类健 康和生活、生态环境的可持续发展不会产生不良影响。饲料安全涉及到原料来源、生 产加工、储存运输和饲喂等多个方面。现在看来，原料来源在词料安全中显得尤为重 要，因为在生物技术的推动下，转基因作物的种植面积越来越大，用于生产饲料的转 基因作物原料越来越多。自1983年，世界上第一列转基因作物问世以来，转基因作物的种类和种植面积 正在扩大。近些年来，转基因作物遍及到了我国各地，截止到2001年底，经过农业 部安全评价批准进入田间环境释放的转基因植物有水稻、玉米、棉花、大豆、油菜等 10种。随之一来，越来越多的转基因作物作为饲料原料被动物所食用，已知大部分 植物DNA比较稳定，在加工过程后仍保持完整，这些DNA作为食物进入动物体内。 至于随着食物在动物体内消化过程的继续，转基因DNA成分的降解程度及其能否被 动物吸收等问题备受人们的关注。Tony等人研究发现Btl76转基因玉米的外源DNA 在鸡肉的胃肠道中仅有部分被降解，仍有大部分DNA能够抵抗消化道酶和微生物作 用而残留。朱元招等人检测了猪回肠末端食糜、粪便中转基因DNA成分，发现有全 部或绝大部分DNA成分被降解，据推测这是由于猪对日粮消化时间比较长而日粮在 鸡体内通过速度较快的原因。虽然人们在小鼠、鸡、猪和牛体内研究了转基因成分代 谢残留状况，结果均为阴性。但是我们一般认为，高拷贝数DNA可在血液、脾脏和 骨骼肌等组织器官中检出。而且，目前的科学水平还不能精确地预测转基因成分所导致的遗传变异效应，所 以，对转基因饲料可能存在的安全问题进行全面的评价已迫在眉睫。国际上对转基因 产品进行标识的呼声也不断高涨，日本、韩国等国都通过立法建立饲料的限制法规和 标识制度。我国对转基因问题一贯持谨慎态度，于2002年颁布了《农业转基因生物 标示管理办法》，规定作为饲料原料的转基因豆粕、玉米、油菜籽粕必须进行标识。目前，我国还没有对饲料中的转基因成分进行限量，但为了确保动物产品对人类健康的安全性，有必要对饲料中的转基因成分进行检测。饲料中的转基因成分分为植 物源和动物源两种，这里我们针对植物源成分，即转基因作物。可用于词料的转基因 作物包括转基因玉米、大豆、油菜籽、棉花籽和马铃薯等。目前，可用于检测饲料中转基因作物成分的方法有多种，但按其原理大致可分为两类基于DNA的PCR检测方法和基于蛋白质的ELISA检测方法。在PCR检测的 过程中，对饲料中总DNA的提取纯化的要求比较高。因为制作饲料需要将作物成分 进行加工、不同程度的配比以及添加辅助成分，这些因素都不同程度地增加了DNA 提取的难度。所以，从饲料中提取高质量的DNA在饲料转基因成分检测中显得尤为 关键。因为词料大多数成分均源于植物，所以，词料DNA提取技术多借鉴与植物DNA 提取方法。目前，大多数实验室提取饲料DNA采用高盐低pH值法、SDS法、CTAB 法或直接购买试剂盒。王培训、张英等分别与1999和2004年对这些方法进行了总结 和评论，几种DNA提取方法各自具有其自身的优缺点，下面分类作简单介绍。高盐低pH值法先用含低剂量SDS的缓冲液裂解样品，然后用高盐低pH值的 溶液沉降杂质萃取DNA，再经反复洗涤后即可得到高纯度的DNA产物。利用该方 法，Salah已经提取了小麦、大麦、马铃薯、大豆、梨、杏等多种植物DNA。此方法 特点为所用试剂、价格低廉、容易配置和保存，产物纯度高，A260/A280比值在 1.9 2.0之间。SDS法利用含高剂量SDS的缓冲液裂解样品，然后通过酚、仿混合液反复抽 提，最后利用TE溶液溶解即可得到目的DNA产物。目前，SDS法普遍应用于植物、 动物和微生物等样品的DNA提取，王景雪应用SDS法提取了玉米、苹果、谷子、油 菜等多种植物DNA。此方法特点为应用广泛，针对大多动植物原料均可适用，提 取的DNA产量大。但是，SDS作为一种阴离子去污剂，高剂量的SDS在裂解细胞 的同时也释放出大量的糖类和蛋白质，容易造成DNA产物污染，质量下降，现在， 一些改良后的SDS方法针对这一现象进行了改善，提取的DNA产物质量也逐渐提高。CTAB法应用含不同浓度CTAB的裂解液批次处理样品，充分裂解样品细胞， 然后经酚、仿混合液反复抽提，再利用乙醇洗涤，最后用TE溶解DNA产物。CTAB 同样作为一种阴离子去污剂，对植物细胞壁具备很强的裂解作为，可以大量的释放细 胞内DNA、糖类和蛋白质等物质，不过CTAB与DNA形成可以溶于高盐溶液的复 合物，当降低溶液中盐浓度时，DNA析出，从而可以有效去除产物中糖类和蛋白质 等杂质。目前，改良后的CTAB法种类较多、应用较广，在此不一一叙述。本实验设计了若干套改良CTAB法提取伺料总DNA的实验方案，经过多次重复实验，根据对实验结果的判断与分析，最后，我们优化出一条成本低廉、耗时短、提取DNA产物质量高的改良CTAB法。玉米是世界上重要的粮食作物之一，也是动物饲料中植物源成分的重要组成部 分，其单位面积产量位居榜首。1999年世界上转基因作物种植面积最大的是抗除草 剂大豆(占转基因植物总面积的54%)，其次为转基因玉米(占28%) 。 MON810 转基因玉米是Monsanto公司运用现代生物技术手段开发推广的转基因玉米，该玉米 中导入的Cry I A (b)基因可抗欧洲玉米螟，其商业化种植以来受到种植业主广泛欢 迎。鉴于MON810转基因玉米在饲料中应用的广泛性，检测饲料中是否含有该玉米 成分的存在已成为检测转基因饲料项目的重要组成部分。我国对于转基因玉米MON810的检测标准已经颁布，"玉米中转基因成分定性 PCR检测方法"SN/T 1196-2003文件为我们检测转基因玉米MON810提供了检测方 法。但是，饲料组成成分更为复杂，在饲料中检测转基因玉米MON810的难度也加 大。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提取用于转基因植物成分检测的词料DNA的方法，以及 该方法的专用提取液。本专利技术所提供的提取饲料DNA的专用提取液，是含有81.816g/L氯化钠，121.1g/L 三羟甲基氨基甲垸，74.448g/L乙二胺四乙酸，20g/L十六烷基三甲基溴化胺，pH值 为8.0的溶液。本专利技术所提供的提取饲料DNA的方法，包括下述步骤-1) 将饲料加入到上述提取饲料DNA的专用提取液中混匀，使所述饲料与所述 提取液的比例为lg: 10ml，加入p-巯基乙醇至终浓度为0.2。/。(体积比)，于65。C温 浴25-30min，离心得到上清液；2) 将步骤l)得到的上清液加入是所述上清液l倍体积的异丙醇混匀，-2(TC静 置15min，然后离心得到初步DNA沉淀；3) 将步骤2)得到的DNA沉淀溶解后，加入TE缓冲液溶解，并加RNA酶至终 浓度10ug/ml， 37。C消化；所述TE缓冲液为含有12.11 g/L三羟甲基氨基甲垸，3.722g/ L乙二胺四乙酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提取饲料ＤＮＡ的专用提取液，是含有８１．８１６ｇ／Ｌ氯化钠，１２１．１ｇ／Ｌ三羟甲基氨基甲烷，７４．４４８ｇ／Ｌ乙二胺四乙酸，２０ｇ／Ｌ十六烷基三甲基溴化胺，ｐＨ值为８．０的溶液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张兴举，王志伟，王趁芳，李奎，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]