本发明专利技术公开了ＬＲＲＣ４基因启动子区甲基化检测在脑胶质瘤诊断中的应用及其检测系统，脑组织特异性表达基因ＬＲＲＣ４是脑胶质瘤特异性甲基化异化基因，因此提示ＬＲＲＣ４基因启动子区甲基化检测可应用于胶质瘤的早期诊断，并制备出ＬＲＲＣ４基因启动子区甲基化检测系统，包括ＤＮＡ亚硫酸氢盐修饰试剂盒和ＬＲＲＣ４启动子区甲基化特异性ＰＣＲ扩增试剂盒。本发明专利技术检测系统检测血浆ＬＲＲＣ４启动子区甲基化状态的特异性可达９２％，灵敏度高，可以定量检测各人群血浆ＬＲＲＣ４启动子区甲基化状态，从而对脑胶质瘤患者做出早期、快速的无创性诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及脑组织特异性表达基因LRRC4启动子区高甲基化在脑胶质瘤 早期诊断中的应用以及一种用于脑胶质瘤早期诊断的LRRC4基因启动子区甲 基化检测系统的开发。
技术介绍
2007年世界卫生组织统计表明在神经系统肿瘤中，胶质瘤发病率最高， 约占40.49%，综合发病年龄高峰在30-40岁，或10-20岁，严重影响了社会 生产力。几十年来，尽管尝试了各种改进的治疗及诊断方案，包括手术治疗、 化疗、放疗和影像诊断技术等，但恶性胶质瘤生存期仍没有明显提高。因此， 对人脑胶质瘤进行高危人群筛查和早期诊断，以便进行早期治疗，显著提高 患者生存率， 一直是神经科学临床研究的重要课题。目前，脑胶质瘤的诊断、分期和分型所参考的标准，均是以临床、病理 学和影像学信息为基础，仍处于经验性标准的阶段，远远不能适应对人脑胶 质瘤进行高危人群筛查和早期诊断的需求。由于遗传性肿瘤标志物"单基因多 靶点"的本质特征和实体瘤细胞水平上的高度异质性严重地干扰遗传性(突 变，LOH和SNP)和表达性分子标志物的检出数据，使得生物标志物(遗传 性及表达性)在临床上的应用具有很大的局限性。近年来，以DNA甲基化为 代表的肿瘤表观遗传学及其在临床诊断、化疗敏感性和预后评价等方面的应 用价值，已经愈来愈受到生命科学工作者的重视，并显示出肿瘤特异性基因 甲基化异化谱式在探寻肿瘤分子标志物方面的巨大潜力。DNA甲基化的异化 可导致基因表达异常和基因组稳定性的降低，并能以半保守的方式高保真的 传递到子代细胞的基因组中，从而促进肿瘤的发生和发展。利用甲基化特异 性聚合酶链反应方法(MSP)分析所获得的肿瘤特异性甲基化谱式，有着定 性、正性指标的优点，很好地避免了上述生物标志物的不足。只要所分析的 靶点区在正常和肿瘤样品中为甲基化状态相反，用MSP法能够从多达104个 正常细胞中检测出l个肿瘤细胞，有着作为早期诊断手段的特异性和敏感性。目前，通过各种体液或固态排泄物进行DNA甲基化谱式分析，对肿瘤高危人群进行普査已被提上议事日程。己有研究表明肺癌发病早期的轻度异型增生阶段，痰中的脱落细胞中抑癌基因pl6INK4a启动子CpG岛可处于高甲 基化状态，预警着肺癌的到来。大便标本中SFRP2甲基化的程度是诊断结肠 癌最灵敏的标记。MGMT、 P73、 RB1、 P16INK4、 RASSF1A和p16启动子区 CpG岛的高甲基化，被认为与胶质瘤的发生相关。定量测定血浆中MGMT、 P73启动子的甲基化水平，可以作为诊断胶质瘤状态的生物学指标。此外，根 据hMLHl启动子的甲基化状态可判断恶性胶质瘤患者的预后。
技术实现思路
本专利技术的目的在于明确证实脑组织特异性表达基因LRRC4 (leucine-rich repeat C4)是脑胶质瘤特异性甲基化异化基因，因此提示脑组织特异性表达基 因LRRC4可用于胶质瘤的早期诊断。本专利技术的另一目的在于制备出LRRC4基因启动子区甲基化检测系统，并应用于脑胶质瘤的早期诊断、筛查和患病风险预测。专利技术人发现脑组织特异性表达基因LRRC4在脑胶质瘤细胞、组织表达 下调或缺失。LRRC4启动子的活性区域-835至-293bp为一典型的CpG岛， 该CpG岛中CpG位点在正常的脑组织和配对血浆中均处于非甲基化状态，而 在LRRC4表达缺失或下调的脑胶质瘤细胞、组织和配对血浆中却存在高度的 甲基化。即使在胶质细胞增生(胶质瘤发生的极早期阶段)的组织和配对血 浆中，LRRC4的表达与正常脑组织的表达几乎没有任何差异时，仍然可以检 测到胶质细胞增生的组织和配对血浆中存在LRRC4启动子区的高甲基化状 态。用甲基化抑制剂5-氮-2脱氧胞苷处理LRRC4基因表达缺失的胶质瘤细胞， 可恢复LRRC4的表达，提示脑组织特异性表达基因LRRC4是脑胶质瘤特异 性甲基化异化基因，是胶质瘤敏感/特异性的早期诊断标志。专利技术人在上述研究基础上，制备了用于人脑胶质瘤早期诊断的LRRC4基 因启动子区甲基化检测系统。该系统包括DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒和 LRRC4启动子区甲基化特异性PCR扩增试剂盒。DNA亚硫酸氢盐修饰试剂 盒包括A液—3M NaOH， B液--lOmM对苯二酚(氢醌)，C液—3.6M亚硫酸 氢钠(pH值5.0)，D液2MNaOH，E液10M醋酸胺以及硅胶纯化柱。LRRC4 启动子区甲基化特异性PCR扩增试剂盒包括用于一对甲基化引物和一对非甲 基化引物，甲基化特异性引物为5,- AGCGTAGTATTTAGCGAGTGC -3 ， (F )， 5，-TAAACCCTAACACCGACTCG-3， (R);非甲基化特异性引物为5 ，-GGGAGTGTAGTATTTAGTGAGTGT-3 ， ( F ) 5'-TAAACCCTAACACCAACTCACTC隱3， (R)。以及用于甲基化对照的经亚硫酸氢盐修饰Sssl甲基化转移酶处理后的gDNA (-2(TC保存)；用于非甲基化对照的经亚硫酸氢盐修饰正常血gDNA (-20°C保存)；及PCR扩增体系的其它常用试剂，如dNTP、 DNA聚合酶、缓冲液(-20'C保存)等。用本专利技术制备的脑组织特异性表达基因LRRC4启动子区甲基化检测系 统，从血浆中进行LRRC4启动子区特异性甲基化检测，可以定量检测各人群 血浆LRRC4启动子区甲基化状态，从而预测脑胶质瘤的患病风险，筛査易感 者，并对脑胶质瘤患者做出早期、快速的无创性诊断。利用本专利技术所述检测 系统检测血衆LRRC4启动子区甲基化状态的特异性好，可达92%;灵敏度高， 只需经亚硫酸盐修饰后50ng组织或血浆gDNA即可检测出LRRC4的甲基化 状态。该检测系统操作简便、稳定性好，不仅可以用于脑胶质瘤的早期诊断， 而且适合用于脑胶质瘤的早期大规模人群筛查与患病风险预测，为脑胶质瘤 的早期诊断与防治提供了强有力的技术支持，具有深远的临床意义和推广性。附图说明图l LRRC4基因启动子的CpG岛的识别结果图2 A图为胶质瘤细胞中LRRC4基因启动子区甲基化特异性PCR产物 电泳图；B图为正常脑组织细胞中LRRC4基因启动子区甲基化特异性PCR 产物电泳图3不同浓度甲基化酶抑制剂5-氮-2脱氧胞苷处理SF126和SF767胶 质瘤细胞后LRRC4表达RT-PCR产物电泳图4 A图为用本专利技术检测系统检测脑胶质瘤患者组织LRRC4启动子甲 基化状态的特异性PCR产物电泳图；B图为用本专利技术检测系统检测脑胶质瘤 患者血浆LRRC4启动子甲基化状态的特异性PCR产物电泳图。具体实施例方式脑组织特异性表达基因LRRC4 (leucine-rich repeat C4)是采用定位克隆 策略从染色体7q31-32区域克隆的新基因，GeneBank登录号AF196976。该 基因在脑瘤尤其是脑胶质瘤中表达下调或缺失，但未发现LRRC4基因的突变、 缺失与重排等遗传方式的改变。表观遗传学可能参与了 LRRC4基因的表达调 控。采用Promoterscan， Genomatix Promoter Inspector及CpGplot等生物信息 学软件对LRRC4基因5'端侧翼序列进行生物信息学分析，结果表明LRRC4 基因的启动子区域可能位于-2475bp至-101本文档来自技高网...
【技术保护点】
脑组织特异性表达基因ＬＲＲＣ４启动子区甲基化检测在脑胶质瘤的早期诊断、筛查和患病风险预测中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李桂源，张祖萍，武明花，李夏雨，李小玲，刘恩伊，李丹，陈攀，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]
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