使用量子点改进聚合酶链式反应的方法技术

本发明专利技术公开了一种使用量子点改进聚合酶链式反应的方法，其步骤是：Ａ．量子点的准备：量子点为水溶性；Ｂ．ＰＣＲ体系的优化：将量子点加入ＰＣＲ反应体系中进行ＰＣＲ扩增；Ｃ．ＰＣＲ产物的检测：对扩增后的ＤＮＡ样品进行琼脂糖凝胶电泳，与对照体系进行比较；Ｄ．量子点从反应体系中的分离并回收扩增得到的ＰＣＲ产物：对反应结束体系进行离心，量子点被离心到底部，取上清得到所需ＰＣＲ产物。本发明专利技术方法简便，操作方便，有效地提高了聚合酶链式反应的专一性和产率，消除了非特异性的扩增和假阳性扩增，增加了聚合酶链式反应的专一性，广泛应用于分子诊断、分子标记、法医鉴定、基因克隆等分子生物学的各个领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种使用量子点改进聚合酶链式反应的 专一性和产率的方法，适用于各种聚合酶链式反应的反应体系。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)是一种快速简便的体外合成核酸的方法，在医学和 生物学中得到了广泛的应用。应用聚合酶链式反应的过程中，特异性和产率是人 们最关心的两个因素。聚合酶链式反应在实际应用中干扰的副作用很多，这些干 扰影响了聚合酶链式反应的特异性和产率，降低了工作效率。例如，引物设计问 题、引物二聚体的存在、模板DNA的GC含量、退火温度、聚合酶链式反应缓冲 液的成分等。更糟糕的是一些副作用可能导致扩增的失败。提高聚合酶链式反应 反应的专一性可以通过一些方式来实现。例如，优化引物设计、优化反应程序和 体系。其中优化聚合酶链式反应反应体系的方法可以通过加入formamide， glycerin, DMS0， BSA等到反应体系中，这在一定程度上改善了聚合酶链式反应 的非特异性。但上述的添加剂的改进效果都有各自的局限，此外一些添加剂，比 如DMS0可能会抑制DNA聚合酶的活性。经过检索现有文献，发现优化效果比较显著的有美国专利US PATENT 5， 646， 019公开的"一种利于引发扩增核酸模板的制备方法"，该方法是在PCR体 系中力口入了耐热的单链结合蛋白(SSB， single-stranded nucleic acid binding protein), SSB蛋白只结合单链DNA，不结合双链DNA，通过结合并抑制含有单 链的非特异性片段的扩增，从而实现了PCR体系的优化。但SSB蛋白合成复杂， 价格较贵，不适合商业化。中屆专利ZL 200410099186. 7公开了向PCR体系中添 加单质金材料来实现对PCR扩增的优化。单质金价格也不菲。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种，方 法简便，操作方便，非常有效地提高了聚合酶链式反应的专一性和产率，而且很 容易的从聚合酶链式反应反应体系中去除添加剂。为了实现上述目的，本专利技术通过向PCR体系中添加量子点来实现对PCR扩增的优化，本专利技术的方法具体如下1、 量子点的准备量子点从市场上购买有4种类型1，表面带正电荷的水溶性量子点(产品型号W—1001 — l),2，表面带负电荷的水溶性量子点(产品型号W—2001 — l),3， 带有羧基功能团的水溶性量子点(产品型号W—3001 — l)，这三种均购置于武汉 珈源量子点开发技术有限公司，另外还使用了 Invitrogen公司的链霉亲和素偶 联的量子点(产品型号Q10141MP)量子点为水溶性，粒径大小为6-50 nm，对 粒径大小没有限制，但粒径大小会略微影响到最适优化浓度。2、 聚合酶链式反应(PCR)体系的优化将适量的量子点(20-50 nM)加入PCR反应体系当中进行PCR扩增。 .按照已有常用PCR扩增技术程序，设定如下 首先模板94 'C变性4分钟；接着25-35个循环，每个循环包括94 。C变性30秒，25-65 。C退火30秒 到1分钟，72 'C延伸30秒到15分钟，其中循环次数、退火温度25-65 'C、退 火时间30秒到1分钟、延伸时间30秒到15分钟，可以根据待扩增对象的长度 和引物(Pl、 P2、 P3、 P4)而不同。(注释循环次数是根据需要获得的产物量 来决定，需要的产物多，则增加循环次数，但循环次数不易超过35个循环；退 火温度是根据反应引物的Tm值来决定，Tm值减5-C为常规退火温度(45-65 'C)， 但这里的体系可以通过大幅降低退火温度(25-65 °C)仍能得到所需目标产物来 增加PCR的产率；根据扩增对象的长度来决定延伸时间，扩增片段每增加1000 bp，需要增加1分钟延伸时间。)最后72'C延伸IO分钟。 1. PCR产物的检测 对扩增后的DNA样品使用质量比为1%的琼脂糖凝胶进行电泳，检查待扩增条带，与对照体系进行比较。可看到在PCR体系中加入量子点可以消除非特异性 的扩增和假阳性扩增，增加聚合酶链式反应的专一性。 2.优化材料(量子点)从反应体系中的分离-如果需要回收扩增得到的PCR产物，则可以对反应结束体系进行短暂离心， 量子点被离心到底部，取上清可以得到所需PCR产物。所述PCR体系参见各种商业聚合酶说明书，以华美公司Taq酶为例，PCR体系的组成为:Taq酶1 UIOXPCR缓冲液2.5 uLdNTP底物(2 mM)2. 5 uLMg2+ (25 mM)1. 5 uL引物1 (0.4 uM)1 uL引物2 (0.4 uM)1模板DNA10 ngddH20补足总体积为25uL所述的量子点为半导体纳米微颗粒。所述的的聚合酶链式反应(PCR)体系包括脱氧核糖核苷酸、耐热DNA聚合 酶、模板DNA和缓冲液，聚合酶链式反应反应液的总体积是25 uL。本专利技术与现有技术相比具有以下优点和效果-使用这里介绍的技术进行聚合酶链式反应实验，相比与传统方法，不但聚合 酶链式反应的产率更高，而且产物的专一性更强。这种方法可以使用在任何形式 的聚合酶链式反应反应。优化体系所引入的量子点可以很容易的从聚合酶f式反 应体系中去除。除了引入的量子点外，不需要新增加任何试剂和仪器，消除了非 特异性的扩增和假阳性扩增，增加了聚合酶链式反应的专一性，可以广泛应用于 分子诊断、分子标记、法医鉴定、基因克隆等分子生物学的各个领域。附图说明图1为不同浓度的量子点对扩增5S rDNA片段的聚合酶链式反应的影响效果图2是对图1的120bp的条带进行定量比较分析的结果效果图； 图3为不同浓度的量子点对扩增单拷贝玉米脂肪醛脱氢酶基因I片段的聚合 酶链式反应的影响效果图。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应当理解，这些实施例仅用于说 明本专利技术而不用于限制本专利技术要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条 件和方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1量子点提高扩增重复序列的聚合酶链式反应的专一性和效率本实施例从玉米基因组DNA中通过聚合酶链式反应反应扩增出5S rDNA重复 序列。为了证明在聚合酶链式反应体系加入量子点能增加聚合酶链式反应的专一 性和提高聚合酶链式反应的产率，申请人进行了如下实验。在这个实验中，聚合 酶链式反应体系包括模板2ng/ul玉米基因组DNA(按照J.萨姆布鲁克等主编， 科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)方法从玉米叶片中提取)，两 对引物(由上海生工合成)Pl和P2 ，序列分别为Pl : 5， -GTGCGATCATACCAGCRYTAATGAACCGG-3， ， P2 :5' -GAGGTGCAACACGAGGACTTCCCAGGAGG-3'，浓度分别为0. 4 uM; 4种脱氧核糖 核酸(dATP、 dCTP、 dTTP、 dGTP)的浓度分别为2mM。 Taq聚合酶购自华美公司。 共配置8管PCR体系，且从1到8编号。所加水溶性量子点(购自武汉珈源量子 点技术开发有限公司，产品型号为W—3001 — l)的浓度分别为l:OnM; 2:1 nM; 3:5 nM: 4: 10 nM; 5: 15 nM; 6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使用量子点改进聚合酶链式反应的方法，其步骤是：　Ａ、量子点的准备：量子点为水溶性，粒径大小为６－５０ｎｍ，所述量子点为半导体纳米微颗粒；　Ｂ、聚合酶链式反应体系的优化：将２０－５０ｎＭ的量子点加入ＰＣＲ反应体系当中进行ＰＣＲ扩增；　设定如下：　首先模板９４℃变性４分钟；接着２５－３５个循环，每个循环包括：９４℃变性３０秒，２５－６５℃退火３０秒到１分钟，７２℃延伸３０秒到１５分钟，循环次数、退火温度２５－６５℃、退火时间３０秒到１分钟、延伸时间３０秒到１５分钟，根据待扩增对象的长度和引物Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４不同；最后７２℃延伸１０分钟；　Ｃ、ＰＣＲ产物的检测：对扩增后的ＤＮＡ样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查扩增条带，与对照体系进行比较；　Ｄ、量子点从反应体系中分离并回收扩增得到的ＰＣＲ产物：对反应结束体系进行离心，量子点被离心到底部，取上清得到所需ＰＣＲ产物；　所述的引物为Ｐ１：５’－ＧＴＧＣＧＡＴＣＡＴＡＣＣＡＧＣＲＹＴＡＡＴＧＡＡＣＣＧＧ－３’；　所述的引物为Ｐ２：５’－ＧＡＧＧＴＧＣＡＡＣＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧ－３’；　所述的引物为Ｐ３：５’－ＧＧＣＣＴＴＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＧＴＴＧ－３’；　所述的引物为Ｐ４：５’－ＧＣＴＧＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＡＴＡＡＴＴＴＧ－３’。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李立家，马璐，何世斌，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]