细胞色素C氧化酶复合体制造技术

本发明专利技术提供了一种新的细胞色素Ｃ氧化酶复合体，用于制备所述复合体的遗传材料，例如包含在细胞色素Ｃ氧化酶复合体的重组多肽，重组ＤＮＡ片段，表达载体，重组生物体及其类似物。这些新的细胞色素Ｃ氧化酶复合体及遗传材料可起源于具有氧化葡糖杆菌ＤＳＭ　　４０２５鉴定特征的微生物。本发明专利技术同样也提供了一种制备所述新的重组细胞色素Ｃ氧化酶复合体的方法及一种生产２－酮基－Ｌ－古洛糖酸（２ＫＧＡ）的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种2-酮基-L-古洛糖酸的重组生产及其中有用的生物材料。
技术介绍
细胞色素C氧化酶(细胞色素aa3；EC 1.9.3.1)是在线粒体及许多细菌中的有氧呼吸电子传递系统中一种末端氧化酶。该酶是一种跨细胞质膜复合体，其催化最终的电子传出；周质表面的亚铁细胞色素C(电子供体)的再氧化/细胞质表面的分子氧(电子受体)向水的还原。这些反应与质子跨膜排出偶连，且这种偶连对于由底物氧化的生物能量储存是必不可少的。不同类型的细胞色素复合体，例如，aa3，a1，caa3，o，bo，co，bd-型，已经被证实其具有末端氧化酶的功能；已经报道了一些末端氧化酶的纯化及表征。Matsushita等报道了醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)IFO3283含有两个末端氧化酶，细胞色素a1及o，并且对细胞色素a1进行了纯化及表征(美国国家科学院院报979863，1990；细菌学杂志174122，1992)。Matsushita等同时也报道了从葡糖杆菌属(Gluconobacter)中分离纯化细胞色素o(生物化学生物物理学通报，894304，1987)。Tayama等也揭示了醋化醋杆菌(A.aceti)中的末端氧化酶(细胞色素a1)基因(JP 93-317054)；他们纯化的氧化酶包括四个亚基(其分子量分别为72，34，21及13kDa)，且含有血红素a及b。醋杆菌属及葡糖杆菌属中的氧化酶同属醌醇氧化酶。细胞色素aa3(细胞色素C氧化酶)已从牛心，酵母，及包括脱氮副球菌(Paracoccousdenitrificans)(Solioz等，生物学化学杂志，2571579-1582，1982)及类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)(Hosler等，生物学化学杂志.，26724264-24272，1992)的细菌中纯化。哺乳动物(线粒体)细胞色素C氧化酶(aa3型)复合体含有13种不同的亚基；三种核心亚基I，II及III(CO I，II及III)由线粒体DNA编码，而其余的10种为核来源。细菌aa3型细胞色素C氧化酶也含有3种核心亚基，其与线粒体核心亚基同源。然而，据报道，纯化时CO III容易丢失，结果导致制品中只含有CO I及CO II(Ludwig等，美国国家科学院院报，77196-200，1980)。随着电化学质子梯度的产生，含有2种亚基(CO I及CO II)的细胞色素C氧化酶复合体显示出一种氧化还原活性。在使用脱氮副球菌(Haltia等，欧洲分子生物学杂志，102015-2021，1991)及类球红细菌(Cao等，基因，101133-137，1991)的情况中，两亚基型(CO I/CO II)型及三亚基型(CO I/II/III)复合体分别由不同的纯化方法分离。从遗传学角度来讲，编码CO II及III的基因位于操纵子中，而编码CO I的基因位于独立位点(Raitio等，欧洲分子生物学杂志，92825-2833，1987；Shapleigh等，美国国家科学院院报，894786-4790，1992)。如上所述末端氧化酶在有氧条件下的生长中在还原分子氧过程中起到关键作用，在有氧发酵时，含有末端氧化酶的呼吸链对于完成底物氧化以产生氧化产物发挥了作用，在本申请中，其对于提高呼吸链的效率以有效氧化发酵至关重要。氧化葡糖杆菌DSM 4025由L-山梨糖经L-山梨酮产生的2-酮基-L-古洛糖酸(以下称2KGA)，是L-抗坏血酸生产工艺过程中的一个重要的中间产物(T.Hoshino等，EP 0366922A)。底物L-山梨糖至2KGA的氧化被认为是通过呼吸电子传递链完成的。催化最终电子排至分子氧的末端氧化酶很可能是在2KGA生产系统及其他氧化还原组份中的一个动力学速率限制步骤。负责从L-山梨糖形成2KGA的原初脱氢酶已被分离(T.Hoshino等，EP606621A)，然后该基因被克隆及测序；发现了四个同工酶(T.Hoshino等，EP832974A)，且他们的直接电子受体细胞色素c551被纯化，其基因被克隆(T.Hoshino等，EP 0869175A)。然而，末端氧化酶却未分离，其基因未克隆。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种物质，其可以提高细胞色素C氧化酶的数量及质量，且改善在使新的细胞色素C氧化酶的基因可得的情况下由细胞色素C氧化酶完成的氧化发酵。保藏号为No.DSM 4025的微生物氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)，其为一个来源优选实例，其提供了本专利技术的新的细胞色素C氧化酶及其遗传物质。本专利技术提供了一种新的细胞色素C氧化酶复合体，其从自然界进行分离或用遗传工程手段制备。这样一种具有细胞色素C氧化酶活性的酶复合体是可获得的，或者得自起源于被鉴定为氧化葡糖杆菌DSM 4025的微生物的生物学或遗传物质，或者得自具有氧化葡糖杆菌DSM 4025鉴定特征的微生物的生物学和/或分类学上同源的培养物。这样本专利技术提供了一种新的细胞色素C氧化酶复合体，其用做呼吸链中介导电子传递的关键成分。这里作为例证的一种细胞色素氧化酶C复合体显示出如下的物理化学特性(i)显示出至少两种核心亚基I(CO I)及II(CO II)的存在，其中使用SDS-PAGE分析手段所获得的CO I的表观分子量大约是43+/-10kDa；COII的表观分子量大约是36+/-10kDa，且(ii)吸收光谱显示出aa3-型细胞色素C氧化酶；其在还原型减去氧化型的差别光谱上表现为605+/-1nm峰。这样一种细胞色素C氧化酶复合体可以被提供为基本上均质的分离物，它来自鉴定为氧化葡糖杆菌DSM 4025的微生物的培养物，或者具有氧化葡糖杆菌DSM4025鉴定特征的微生物的生物学和/或分类学上同源的培养物。本专利技术的一种新的细胞色素C氧化酶复合体同样可以以一种重组酶的形式提供，其可以包括一个重组多肽作为核心亚基I(COI)，其中的重组多肽可以选自含有具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽，及那些具有与所述序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能够为复合体提供细胞色素C氧化酶活性的多肽。更进一步讲，其它两个亚基II(CO II)及III(CO III)可以为重组多肽，其选自含有如SEQ ID NOs4，6和/或8所示的氨基酸序列的多肽，及那些含有具有与所述任一种氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能够为复合体提供细胞色素C氧化酶活性的多肽。作为本专利技术的另一方面，各自核心亚基，即CO I，CO II及CO III可以以重组多肽形式提供，其用于本专利技术的新的细胞色素C氧化酶复合体的组份。这里作为例证的COI为一重组多肽，其包含于细胞色素C氧化酶复合体，其中多肽包含有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或者该多肽具有与所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能够为复合体提供细胞色素C氧化酶活性。一个重组的COI可以为能够为如本专利技术所述的复合体提供细胞色素C氧化酶活性的一种多肽，其被一种重组DNA片段编码，所述DNA片段包含选自下述组份的DNA序列(a)如SEQ ID NO1所示的DNA序列，及(b)编码具有如SEQ ID NO2所示氨基酸序列或者具有与所述氨基酸序列有85％或者本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从Ｌ－山梨糖或Ｄ－山梨糖醇中制备２－酮基－Ｌ－古洛糖酸的方法，该方法包括在合适的培养基中培养重组生物体并从培养基中回收２－酮基－Ｌ－古洛糖酸，所述重组生物体载有编码多肽的重组ＤＮＡ，所述多肽包含于具有细胞色素ｃ氧化酶活性的细胞色素ｃ氧化酶复合体中，它可获自或来源于鉴定为氧化葡糖杆菌ＤＳＭ４０２５的微生物或具有氧化葡糖杆菌ＤＳＭ４０２５鉴定特征的微生物的生物学和／或分类学上同源的培养物的生物学或遗传材料。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：浅仓昭，星野长尾，真城正子，
申请(专利权)人：DSMIP资产有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]