用于工业生产柠檬酸的基因制造技术

本发明专利技术涉及新鉴定出的基因，其编码柠檬酸（生物）合成中涉及的蛋白质。本发明专利技术还涉及：包含所述新颖基因的全长多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸编码的新颖的多肽及其片段，以及它们的功能等同物。本发明专利技术还涉及所述多核苷酸和多肽作为生物技术工具在从微生物生产柠檬酸中的用途，其中对所述多核苷酸和／或被编码的多肽的修饰对所述微生物中生产发酵产物的产率、产量和／或效率有着直接或间接的影响。本发明专利技术还包括使用多核苷酸和经修饰的多核苷酸序列转化宿主微生物的方法／工艺。本发明专利技术还涉及经过遗传工程改造的微生物及其用于生产柠檬酸的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于工业生产柠檬酸的基因本专利技术涉及新鉴定出的基因，其编码柠檬酸(生物)合成中涉及的蛋 白质。本专利技术还涉及包含所述新颖基因的全长多核苷酸序列的多核苷酸 及其片段，所述多核苷酸编码的新颖的多肽及其片段，以及它们的功能等 同物。本专利技术还涉及所述多核苷酸和多肽作为生物技术工具在从微生物生 产柠檬酸中的用途，其中对所述多核苷酸和/或被编码的多肽的修饰对在所 述微生物中生产所述发酵产物的产率、产量和/或效率有着直接或间接的影 响。本专利技术还包括使用所述多核苷酸和经修饰的多核苷酸序列转化宿主微 生物的方法/工艺。本专利技术还涉及经过遗传工程改造的微生物及其用于生产 柠檬酸的用途。专利技术背景柠檬酸(2-羟基-丙烷-l，2，3-三羧酸)是已知的工业上重要的有机酸， 其可用作为，例如，食物添加剂、防腐剂或油或脂肪的稳定性，因为其具 有络合重金属离子，例如铜和铁的能力。最初，从柑橘类植物中分离出柠 檬酸。对柠檬酸的化学合成也是可能的，但是，这根本不适合进行工业生 产，因为原材料昂贵，工艺复杂，产率低下。因此，在过去数十年来，人们在研究使用微生物转化制造柠檬酸的其 它手段，这将更经济更环保。使用不同培养方法从多种底物(包括葡萄糖或蔗糖)生产柠檬酸已被 报道于若干种微生物中，例如真菌，包括酵母。能直接生产柠檬酸的已知真菌的例子包括，例如，来自J^e^7/^属的菌株，特别是A m'ger，或 酵母，例如y"/rcw/"，特另!j是yia;rcw/fl /ir》o/jricfl 。底物(例如，碳水化合物)向柠檬酸的转化可能涉及很多不同的代谢 途径，并且牵涉到很多酶促步骤，以产生柠檬酸。此外，转运蛋白可能在 底物向拧檬酸的高效转化中发挥重要作用。在将物质，例如碳水化合物(例如葡萄糖或糖醇)、羧酸盐/酯、矿物 质、毒性化合物(例如反应活性氧)以及相关化合物在膜上转运的过程中 具有活性的蛋白质(特别是转运蛋白)，在本文中被认为涉及转运系统 (TS)。这种转运可以是运进胞质，运进/出线粒体、液泡、内质网、过 氧化物酶体或运经另外的膜屏障。此类蛋白在本文中被縮写为TS蛋白， 其在柠檬酸合成中具有功能，或在细胞内合成柠檬酸的过程中具有功能。一般而言，TS蛋白是膜结合的，或者与膜结合的结构相关，它们作为 单种蛋白质或作为蛋白质复合物(例如透性酶或活性转运蛋白)中的亚基发挥功能。TS蛋白已知负责选择性促进、协助或使得化合物(例如，糖、糖醇、羧酸盐/酯、矿物质、毒性化合物)能够被转运经过细胞膜、周质膜 或线粒体的液泡膜、内质网膜或过氧化物酶体膜。可基于其机制将TS蛋白质分为若干类。第一组转运蛋白也被称为离子通道，其使用来自质子运动力的能量，逆浓度梯度转运分子。同向转运 和反向转运系统将两种不同分子经过膜的移动偶联起来(通过针对两种不同分子具有两个单独结合位点的透性酶)；在同向转运中，两种分子以同 样的方向被转运；而在反向转运中， 一种分子运进而另一种运出。还有一类被称为"次级转运蛋白"的转运蛋白一一磷酸转移酶系统(PTS)通过高能量磷酸基团从磷酸烯醇丙酮酸经由多种蛋白组分向底物 的转移获得能量，底物在运入时被磷酸化为磷酸酯形式。该组的离子转运 蛋白协助在膜上的扩散，例如，阳离子扩散协助蛋白(CDF)家族，或协 助交换阴离子，例如阴离子交换蛋白(AE)家族。该组主要易化超家族(Major Facilitator Superfamily， MFS)含有多种重要的糖转运蛋白。另一组转运蛋白将ATP的水解与底物易位偶联起来。这些系统被称为 ATP结合盒(ABC)型转运蛋白。ABC转运系统由底物特异性结合蛋白(在革兰氏阴性细菌中位于周质中，或者，在革兰氏阳性细菌中与膜相 关)、整合膜结构域和面向胞质的ATP水解结构域构成。对膜转运系统的更详细描述可在Bamberg, E. et al (1993) "Charge transport of ion pumps on lipid bilayer membranes", Q. Rev. Biophys. 26:1-25; Findlay， J.B.C. (1991) "Structure and function of membrane transport systems",Curr. Opin. Struct. Biol.丄:804-810; Higgins, C.F. (1992) "ABC transporters from microorganism to man" Ann. Rev. Cell Biol. 3:67-113; Gennis， R.B. (1989) "Pores, channels and transporters" in: Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer, Heidelberg, p. 270-322; Nikaido， H. & Saier H. (1992) "Transport proteins in bacteria: common themes in their design" Science 258:936-942中找到。优选地，TS蛋白或此类蛋白的具有针对从碳水化合物合成拧檬酸的活 性或涉及所述合成的亚基选自由己糖转运蛋白、离子转运蛋白、激酶、透 性酶、同向转运蛋白、反向转运动蛋白、线粒体运载体(例如柠檬酸盐转 运蛋白)或三羧酸盐运载体、线粒体组蛋白的遏制子(suppresor)和金属 转运蛋白(例如，锰转运蛋白或锰抗性蛋白或铁转运蛋白)构成的组。在参与柠檬酸盐/酯合成的蛋白质，特别是酶，例如参与TCA的酶， 例如，催化乙酰CoA与草酰乙酸盐/酯縮合形成柠檬酸的酶，在本文中被 称为涉及柠檬酸盐/酯合成系统，并被縮写为CS蛋白，其在柠檬酸合成中 发挥功能。优选地，CS蛋白或者此类蛋白的具有针对柠檬酸盐/酯合成的活性或 参与柠檬酸盐/酯合成的亚基选自由柠檬酸盐合酶、乙醛酸循环体柠檬酸盐 合酶、乌头酸酶、乌头酸盐水合酶或水解酶以及6-磷酸果糖激酶。参与侧支反应的蛋白质，特别是酶，例如，Mn依赖性线粒体超氧化 物歧化酶(MnSOD)，参与所谓的柠檬酸合成途径"旁路"的基因，例 如，草酰乙酸水解酶、葡糖氧化酶和/或乙醇酸盐(氧化)还原酶，可能对 柠檬酸合成的细胞内过程造成影响。此类酶在本文中被縮写为BS蛋白或 BS酶。以前已报道过用Aspergillus的菌株来生产柠檬酸(见，例如，Karaffa and Kubicek, Appl Microbiol Biotechnol， 61:169-196, 2003)。然而，如现有技术所知，柠檬酸生产的产率和/或生产能力仍可被提高，这正是本专利技术的 目的之一。附图说明图1: BS08基因置换型载体pGBDEL-SODA的质粒图谱。 该质粒用于打断BS08基因。标出了相对于amdS标记而言的5' BS08 侧翼区域(示为5， sodA)和3， BS08侧翼区域(示为3， sodA) 。 BS08 3， 片段的序列在序列上覆盖至少数百bp。通过在转化A. niger菌株之前用限 制性酶^出I和Xwal消化来除去E. coli DNA。 图2: BS本文档来自技高网...

【技术保护点】
选自下述组的ＴＳ０８和／或ＴＳ０９多核苷酸或此类多核苷酸的互补链，所述组由：　（ａ）编码分别包含选自ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７的氨基酸序列的ＴＳ０８或ＴＳ０９多肽的多核苷酸；　（ｂ）包含根据ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６的核苷酸序列的多核苷酸；　（ｃ）包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用来自微生物的基因组ＤＮＡ作为模板，并分别使用根据ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９的引物组，通过核酸扩增，例如聚合酶链式反应，来获得；　（ｄ）多核苷酸，其包含编码被（ａ）至（ｃ）中任一项的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有ＴＳ０８或ＴＳ０９多肽的活性；　（ｅ）编码ＴＳ０８或ＴＳ０９多肽的多核苷酸，且其互补链能在严谨条件下与（ａ）至（ｄ）中任一项所定义的多核苷酸杂交；以及　（ｆ）编码ＴＳ０８或ＴＳ０９的多核苷酸，且其与（ａ）至（ｄ）中任一项所定义的多核苷酸至少７０％同源，例如７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８或９９％同源；　构成。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡戈马克卡雷尔鲍威利尔斯，多米尼奇罗伯特格洛森肯，诺尔尼古拉斯玛丽亚伊丽莎白佩伊凡，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]