【技术实现步骤摘要】
泰科菌素(teicoplanin)[以前被称为泰科霉素(teichomycin)]是通过培养微生物(Actinoplanes teichomyceticus nov.sp.)[ATCC(美国标准菌库)31121]所产生的糖肽抗生素。这种抗生素主要是对于革兰氏阳性菌所引起的感染是有效的。根据美国专利第4，239，751号所描述的方法，泰科菌素是从以含有三个因子A1、A2和A3的复合体形式的菌株的发酵肉汤培养基中分离出来的。因子A2大量存在于从上述菌株的发酵所回收的抗生素复合体之中，而且对它的生物活性是最重要的。因子A1和因子A3仅以微量存在的。按照美国专利第4，239，751号，泰科菌素A(teicopanin A2，简称T-A2)是通过在葡聚糖凝胶RLH-20上的柱型色层分离法从泰科菌素复合体的其他因子中分离出来的，该交联葡聚糖凝胶 LH-20是其摈斥限度为大约4.000分子量的交联的多葡聚糖凝胶的羟丙基衍生物。通过大规模的制备和纯化操作(欧洲专利申请公开第0122969号已举出了这些操作的例子)，通常可获得主要是由泰科菌素A2组成、并伴有少量泰科菌素A...
【技术保护点】
一种制备选择性富含有其主要组份Ｔ－Ａ２－１、Ｔ－Ａ２－２、Ｔ－Ａ２－３、Ｔ－Ａ２－４或Ｔ－Ａ２－５的任何组份的泰科菌素Ａ↓［２］（Ｔ－Ａ２）的方法，它包括在微生物（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ－ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ－ｎｏｖ－．ｓｐ＃ＡＴＣＣ（美国标准菌库）３１１２１］或它的一种能经过相同代谢途经产生Ｔ－Ａ２的突变体之一的培养基中加入选择性有效量的Ｔ－Ａ２的氨基葡萄糖部分的相应酯基团的合适前体，具体步骤如下：ａ）用于增加Ｔ－Ａ２复合体中Ｔ－Ａ２－１比率的合适前体从亚 油酸、它的对微生物无毒性的带有碱的盐和它的带有单－和多－羟基低级链烷醇的酯中被挑选出来，ｂ）用于...
【技术特征摘要】
GB 1985-5-21 8512795书中每个单一形式各自和以任何比率单一形式的混合物是需要的。对微生物无毒性的酯是(C2～C22)链烷醇酯，其中，发酵培养基中链烷醇部分的类型及浓度是这样的，而它在很大程度上不会损害微生物培养基的生长或所需的抗生素物质的生产。一般说来。直链的(C2～C22)链烷醇是更为可取的。本发明的方法包括，在生产泰科菌素的现有技术中所描述的一般条件下，在含有可同化碳源、可同化氮源和无机盐源的营养培养基水溶液中培养以上所述的菌株，加以改进的地方是在接种菌株之前或在发酵过程中把一种选择性有效量的合适前体加入到发酵培养基中从而选择性地增加一种或多种泰科菌素A2组份即T-A2-1、T-A2-2、T-A2-3、T-A2-4、和T-A2-5的生产。“通过同样的代谢途径生产T-A2复合体的突变体”这一词白系指那些微生物(Actinoplanes teichomyceticus)[ATCC(美国标准菌库)31121(亲本)]的天然或人工突变体，这些突变体通过使用基本上相同的酶促系统作为亲本生产T-A2复合体从而提供T-A2复合体的R1脂肪酰基部分。在本说明书和权利要求书中，“选择性有效量”这一词句是指一定的选择性前体的量，当它加入到培养基中时，会产生出一种浓度足以引起T-A2复合体中一个特定组份的选择性增加，而对微生物则无毒性。适用于T-A2生产菌株(本发明实施例中所用的菌株)发酵的营养发酵培养基通常含有一种合适的碳源，碳源可选自糖(如，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖)、多糖类(例如，淀粉、葡聚糖)多醇(例如，甘油、丙二醇)中挑选出来;合适的氮源，例如可以从铵盐、天冬酰胺、花生粉、大豆粉、肉汁、胰化胨、蛋白胨、酵母水解产物、酵母提液和玉米茎液中挑选出来;酸性矿物盐，例如氯化钠、碳酸钙、硫酸镁。发醇过程是在有氧的条件下进行的，时间为50～200小时不等，温度为25～35℃，最好为27～33℃。在接种生长菌株之前，把选择性有效量的合适前体加入到发酵培养基之中，然而，这种加入最好是在发酵过程开始后的24～48小时时进行。这种加入方式可以是一次完成也可分几次完成或以连续的方式进行。根据体现本发明的典型实验，培养在燕麦粉琼脂斜面上的Actinoplanes teichomyceticus菌株被接种到含有100毫升营养培养液的烧杯中。36小时以后，该培养物的样品(5毫升)被用来接种在一系列含有100毫升发酵培养基的发酵烧杯中。经过24～48小时的发酵之后，选择性有效量的前体作为合适物质被加入。假如需要伴随增加T-A2复合体中两种或多种主要组份的，那么就可在同一发酵烧杯中加入两种或多种前体。然后，让发酵过程再继续进行60～150小时，接着将培养基通过离心作用除去，并通过高效能液相色谱分离法(HPLC)分析发酵液样品中T-A2主要组份的浓度。前体的加入通常是通过这样的途径进行的，即，它不改变发酵培养基中预先确定的PH值。于是，例如当游离酸培养基直接加入到该培养基中去时，可以通过缓冲液处理培养基或用碱(对微生物无毒性)进行直接中和从而使PH值保持在受控之下。当加入的前体是一种氨基酸时，就能以它的对生长的微生物无毒性的带有酸或碱的盐的水溶液(例如盐酸化物和钠盐)被应用到发酵培养基中。外消旋混合物和光学上有活性的异构体均可能用作前体。然而，至少在某些例子中，L-结构体的加入比相应的D-结构体的加入可得到更高的产量。本发明方法的一种理想的具体实施例可通过对L-氨基酸前体的使用来进行叙述，所说的L-氨基酸前体用于增进泰科菌素A2复合体中T-A2-2(缬氨酸、其盐或酯)、T-A2-4(L-异亮氨酸、及其盐或酯)和/或T-A2-5(L-亮氨酸、及其盐或酯)的浓度。根据这一理想的具体实施例，也有可能在发酵产物中使T-A2-2、T-A2-4或T-A2-5的百分数增加到该复合体的90～95%。对低级链烷酸前体(例如，异丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸α-酮基-异戊酸、α-酮基-β-甲基戊酸和α-酮基-异己酸)而言，这种加入是通过它们的带有非毒性碱的盐的水溶液形式进行的;通常最好是采用铵盐和钙盐。当不饱和的酯肪酸盐，例如亚油酸和油酸，被用作合适前体时，一般说来最好是用钠盐和铵盐。然而，也可以使用对生长的菌株无毒性的任何带有碱的盐。当上述低级链烷酸和不饱和的带有单-羟基低级链烷醇的脂肪酸的酯被用作前体时，所说的酯通常是从甲醇、乙醇和丙醇中衍生出来的，尽管具有C4～C6的链烷醇的酯也可被使用。在这种情况下，这些C4～C6链烷醇必须是不同于那些也可用作其它T-A2主要组份的前体的链烷醇(例如，异丁醇、异戊醇和2-甲基丁醇)除非需要伴随增加一种或多种所述组份。上述低级链烷酸和不饱和脂肪酸(带有多-羟基低级链烷醇的)的理想酯类是那些带有1，2-亚乙基二醇和甘油、例如三异酪脂(trii-sobutyrin)、三油精(tri-oleine)、和三亚油精(tri-linoleine)的酯。不饱和脂肪酸的加入也可通过使用含有所说的酸或它们的甘油酯的天然原料来进行。例如，市场上的大豆油通常含有约20～35%的油酸和大约50～60%的亚油酸(均以甘油三酯的形式存在);猪脂含有约40～50%的油酸;棉籽油含有约20～55%的亚油酸;葵花籽油含有约15～25%的油酸和大约65～75%的亚油酸。象异丁醇、异戊醇和2-甲基丁醇这样链烷醇前体通常是照此被加入发酵培养基的。然而，它们也可作为对微生物无毒性的酸的酯而被应用。这些酸必须是不同于能用作其它T-A2主要组份的前体的那些酸(例如，异丁酸、异戊酸、2-甲基丁酸、亚油酸等等)，除非需要伴随增加一种或多种所述组份。一般说来，最好是具有直链低级链烷酸例如乙酸、丙酸和丁酸的酯。按照本发明要被加入发酵培养基中去的“选择性有效量”是取决于前体的类型的，通常，对低级链烷酸(异丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸)的酯和不饱和脂肪酸(亚油酸、油酸)的酯来说，所采用的加入量应该是能在发酵培养基中获得0.5～15克/升这一范围的浓度，最好能获得1～5克/升的浓度。对低级链烷醇(异丁醇、2-甲基丁醇、异戊醇)或它们的对微生物无毒性的带有酸的酯来说，通常所采用的加入量应能获得0.5～5克/升这一范围的浓度，最好能获得1～2克/升的浓度。对氨基酸(例如，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)和酮基酸(α-酮基-异戊酸、α-酮基-β-甲基戊酸、α-酮基-异己酸)或它们的带有酸和碱的盐来说，被加入到发酵培养基的“选择性有效量”通常是在0.5～5克/升这一范围，最好是1～3克/升。在低级链烷酸(例如异丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸)、不饱和脂肪酸(例如亚油酸、油酸)或它们的盐被直接加入到发酵培养基的情况下，“选择性有效量”通常为0.1～2.5克/升这一范围，最好是0.3～1.5克/升。较高的浓度在增进T-A主要组份的选择性增加方面仍然是有效的，但由于对微生物产生了毒性作用，因此T-A2复合体的总产量却降低了。以下的实施例将详细地描述本发明的一些特定的具体体现。实施例1一般程序燕麦粉琼脂斜面上的微生物(Actinoplanes teichomyceticus nov.sp.)[ATCC(美国标准菌库)31121]被接种到含有100毫升下列营养培养基的500毫升的烧杯中。葡萄糖 10克/升的夫考胨(Difco) 4克/升酵母提液 4克/升MgSO40.5克/升CaCO35克/升标准痕量元素 1毫升 溶液A、B和C每一种溶液水 1000毫升(消毒后的 PH值被调整到6.7)溶液A10%氯化钠(重量/体积)溶液B10%氯化钙(重量/体积)溶液C在100毫升的蒸馏水中有H3BO350毫克;CuSO44毫升;KI10毫克;FeCl320毫克;MgSO440毫克;FeSO440毫克;(NH4)MoO420毫克在旋转的搅拌器上生长36小时后，5毫升的培养物被用来对含有每100毫升具有以下组成的发酵培养基的试验烧杯和标准烧杯进行接种。酵母利塞特(lisate) 5克/升天冬酰胺 1.5克/升葡萄糖 20克/升MgSO40.5克/升CaCO35克/升标准痕量元素 1毫升 溶液A、B和C中的每一种水 1000毫升(消毒后的PH值被调整到6.9)溶液A、B和C与以上相同发酵过程是在旋转式搅拌器上于28～30℃的温度下进行的。经过24小时之后，加入合适的前体。72小时之后，将培养物进行离心分离，然后分析了50微升液体培养基样品中的T-A2主要组份的浓度。该分析是根据以下的高压液相色谱(HPLC)进行的a，通过梯度反相分配进行分离仪器伐灵(Varian)泵5000A;254微米的伐灵(Varian)检测器;注射器罗丁(Rheodyne)型7125;积分器光谱物理型4000;柱曹白克斯R(ZorbaxR)十八烷5微米，4.6×50毫米;(杜邦公司)流动相A> CH3CN0.025M的NaH2PO41∶9，PH6.0B> CHCN0.025M的NaH2PO47∶3，PH6.0梯度分布图在30分钟内(直)线型从B的0%达到B的50%流速为2毫升/分钟注射50微升发酵液体培养基保留时间(分钟)T-A2-1 ＝16.9T-A2-2 ＝18.0T-A2-3 ＝18.6T-A2-4 ＝20.5T-A2-5 ＝20.9内部标准3.5-二羟基甲苯(保留时间6.3分钟)b.百分分配这些组份可通过上述方法得到分离，它们的相对分配可通过区域百分方法以五个峰值的总的百分比获得。 实施例2一般程序在含有100毫升以下培养基的500毫升摇动烧杯中对微生物(Actinoplanes teichomyceticous nov.sp.)[ATCC(美国标准菌库)31121]进行预培养。肉提液 3克/升胰化胨 5克/升酵母提液 5克/升葡萄糖 1克/升可溶淀粉 24克/升碳酸钙 5克/升水 100克/升(消毒后的PH值被调整到6.7)然后这些烧杯在28～30℃的温度下摇动24小时，接着采用预培养物对每一个都含有10升下列营养培养基的罐式发酵器进行接种。肉提液 4克/升胨 4克/升酵母提液 1克/升氯化钠 2.5克/升大豆粉 10克/升葡萄糖 50克/升碳酸钙 5克/升自来水 适量至1000毫升(消毒后的PH值被调整到6.9)这些发酵器在搅拌下，并在有氧条件下接受培养达24小时，然后再往里加入合适前体。发酵过程再继续90小时，之后就可以从这些发酵器中采集产物。液体培养基的样品(100毫升)在PH值为11[通过加入20%(重...
【专利技术属性】
技术研发人员：福郎斯科爱舍，简卡劳兰希尼，阿纳克莱脱简南脱尼，
申请(专利权)人：莱匹梯特协会，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]
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