人体胰岛素前体转化为人体胰岛素的方法技术

本说明书介绍了一种人体胰岛素前体转化为人体胰岛素的方法，包括在水介质中用胰蛋白酶和羧肽酶Ｂ处理该种人体胰岛素前体。该水介质中含每摩尔人体胰岛素前体约０．１至１０摩尔的１种或多种具有原子序数为２１至３４、３９至５２、５７至８４和８９至９２的金属的金属离子。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
几年来人们已经认识到用胰蛋白酶和羧肽酶B使胰岛素原转化为胰岛素的能力〔参阅Kemmler，W.，Clark J.L.，Borg.J.and Steiner，D.F.，Fed.Proc.30 1210页(1971);Kemmler，w.，Peterson，J.D.，and Steiner，D.F.，J.Biol.Chem.，246 6786-6791页(1971)〕。应用这种转化的方法，在进行中迂到的困难是，并且继续是在反应混合物中存在大量难以去除的副产品。更具体来说，在人体胰岛素原转化为人体胰岛素中，形成大量脱苏氨酸(B30)人体胰岛素〔Des-Thr(B30)-hI〕(约4～6%)。这种由于不带单个末端氨基酸而有别于人体胰岛素的副产物，即使真能从反应混合物中分离出来，其分离方法是困难而麻烦的。随着重组DNA技术的出现，使首次人工合成大量胰岛素原成为现实。在生产胰岛素使用人体胰岛素原作为中间产物时Des-Thr(B30)-hI杂质问题必需解决，人们或是寻求从污染的Des-Thr(B30)-hI中使人体胰岛素纯化的方法或是寻求在转化方法中将Des-Thr(B30)-hI的形成减到最少的条件。本专利技术指引使人体胰岛素前体转化为有极少的Des-Thr(B30)-hI形成的人体胰岛素的一种新方法。因此，本专利技术目的在于提供使。这种前体具有下面的化学式 式中R是氢、用化学或酶促法可切割的氨基酸残基，或者用化学或酶促法可切割的至少带有两个氨基酸残基的肽部分;R1是OH、Arg-Y，或Lys-Y，其中Y是OH、氨基酸残基，或者至少含有两个氨基酸残基的肽部分;从A-1至A-21部分是人体胰岛素A链;从B-1至B-30部分是人体胰岛素B链;以及X是胰岛素A-链上A-1的氨基与胰岛素B链上B-30的羧基之间相互连接的部分，这部分可被酶促地从A-链和B-链上裂下而不破坏A链和B链，它包括在水介质中用胰蛋白酶和羧肽酶B处理这种人体胰岛素前体，在该水介质中每摩尔人体胰岛素前体约有0.1至10摩尔的一种或多种金属离子，这些金属具有原子序数21至34、39至52、57至84和89至92。正如所指出的，本专利技术的方法显示出增强了公认的用胰蛋白酶和羧肽酶B将胰岛素原转化为胰岛素的作用。该方法用于上述化学式的人体胰岛素前体。尤以人体胰岛素原本身为最佳。本文所用的“人体胰岛素前体”一词是指下述分子(1)含人体胰岛素A链和人体胰岛素B链，(2)至少具有通过分别在A-链和B-链上的(a)A-6和A-11，(b)A-7和B-7(c)A-20和B-19上的每个Cys部分的硫相连接的三个二硫键，以及(3)具有与胰岛素A链的A-1氨基与胰岛素B链的B-30羧基连接的可除去连接部分。R是氢、氨基酸残基，或至少具有两个氨基酸残基的肽部分。其中在R是氨基酸残基或肽部分的情况下，R是可从没有损失残余胰岛素完整结构的胰岛素前体产物切割的基。众多氨基酸残基或肽部分之任一种都限制在基团R的定义范围内。可切割的氨基酸残基的实例是碱性氨基酸，如精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)及由这些氨基酸残基的羧基终止的肽部分。这些氨基酸残基被公认为在用蛋白水解酶胰蛋白酶处理时易于被切下。可切割的氨基酸残基的又一实例是蛋酸(Met)，还有在其羧基末端具有Met的肽部分。通过用溴化氰处理可去除这些残基。再一实例是色氨酸(Trp)或在其羧基末端含Trp的肽部分。用N-溴丁二酰亚胺处理，可去除这种残基。基团R1是羟基、精氨酸、赖氨酸或在氨基末端具有精氨酸或赖氨酸的肽。当R1是精氨酸、赖氨酸、或在氨基末端具有的任何一个这些残基的肽时，在本专利技术方法的条件下，氨基酸或肽。会被切下同时形成R1是羟基的产物。胰岛素前体的连接部分X可以是各种结构之任一种，以X部分是多肽为最佳。多肽一般至少有2个氨基酸残基，更好为约2至35个氨基酸残基，以约6至35个氨基酸残基为最佳。X部分与A链上A-1的氨基和与B链上B-30的羧基相连接。最佳情况是当连接部分X是肽时，是人体胰岛素原的天然连接肽，这种连接肽具有下述化学式-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-.尽管最好使用如以上所示的天然连接序列，但短得多的肽序列可用于连接肽，只是要求(1)他们的长度足以使A链和B链间形成合适的二硫键，(2)随着胰岛素的形成它们可以从胰岛素前体上裂下。可使用的典型二肽是-Arg-Arg-。此外，可方便地采用具有式-Arg-X-Arg-的改进的上述二肽，(其中X至少表示1个氨基酸残基)。最佳连接的肽是-Arg-Arg-Lys-Arg-及具有结构-Arg-Arg-X2-Lys-Arg-的较长链的肽，其中X2至少是1个氨基酸残基，最佳为至少2个氨基酸残基。当然，后者包括天然的连接肽。本专利技术的方法是在水介质中进行的。水介质一词“要求有水存在，然而不排除有与水易混溶的有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺等存在。人体胰岛素前体存在于介质中的浓度不超过约20毫克分子。最佳的是人体胰岛素前体的浓度基本上较低，一般约0.1毫克分子至10毫克分子，较好为约0.5至5毫克分子，最佳为约1至3毫克分子。可在任意温度范围下进行转化，一般在约0℃至40℃，进行反应的较好温度约4℃至25℃，最佳为约10℃至15℃。反应混合物的pH可在4至12的任意值。然而，通过严格控制pH为6至9，最好在约7至8下进行，当精确控制时，在约7.2至7.6时可得到最好结果。一般通过使用缓冲剂来帮助控制pH值，可采用任意一种pH范围广的典型的缓冲剂。适宜的缓冲剂的例是TRIS(三羟甲基氨基甲烷)、乙二胺、三乙醇胺、甘氨酸、HEPES(N-2-羟基-乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸)等。所用胰蛋白酶和羧肽酶B的量一般与这两种酶和人体胰岛素前体的量都有关。这些酶或可加到反应混合物的溶液中，或用已知的技术，可固定在适宜的载体上，从而可在反应介质中起作用。根据重量∶重量计，通常所存在的羧肽酶B相对于人体胰岛素前体的量约1∶10至约1∶5000，较好为约1∶500至约1∶3500，最佳为约1∶1000至约1∶3000。根据重量∶重量计，通常所存在的胰蛋白酶相对于人体胰岛素前体的量约1∶20至约1∶250000，较好为约1∶300至1∶20000，最佳为约1∶5000至1∶15000。在反应混合物中羧肽酶B对胰蛋白酶的比率也是一个重量参数。一般以重量计，羧肽酶B对胰蛋白酶的比率约为1∶1至约10∶1，最好为约2∶1至约5∶1。构成本专利技术基础的关键发现在于找到了在一种或多种广泛的一定量的金属离子，显著地减低了在反应中形成Des-Thr(B30)-hI的量。虽然某些金属离子是非常好的，但业已发现这些金属离子在一个广范围内都是可以应用的。可以采用的是以下金属的离子钪(Sc)、钛(Ti)、钒(V)、铬(Cr)、锰(Mn)、铁(Fe)、钴(Co)、镍(Ni)、铜(Cu)、锌(Zn)、镓(Ga)、锗(Ge)、砷(As)、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使人体胰岛素前体转化为人体胰岛素的方法，这种前体的化学式为：＊＊＊式中Ｒ是氢、用化学的或酶促的方法可切开的氨基酸残基，或者用化学的或酶促的方法可切开的至少含有两个氨基酸残基的肽部分；Ｒ↓〔１〕是ＯＨ、Ａｒｇ－Ｙ，或Ｌｙｓ－Ｙ ，其中Ｙ是ＯＨ、氨基酸残基，或者至少含有两个氨基酸残基的肽部分；从Ａ－１至Ａ－２１部分是人体胰岛素Ａ链；从Ｂ－１至Ｂ－３０部分是人体胰岛素Ａ链；从Ｂ－１至Ｂ－３０部分是人体胰岛素Ｂ链；以及Ｘ是与胰岛素Ａ链上Ａ－１的氨基和胰岛素Ｂ链上Ｂ－ ３０的羧基相连接的部分，这部分可以被酶促地从Ａ链或Ｂ链上切开而且不破坏Ａ链和Ｂ链，它包括在水介质中用胰蛋白酶和羧肽酶Ｂ处理这种人体胰岛素前体，该水介质含每摩尔人体胰岛素前体约０．１至１０摩尔１种或多种具有原子序数２１至３４、３９至５２、５７至８４和８９至９２的金属离子。

【技术特征摘要】
US 1986-10-14 9179391.一种使人体胰岛素前体转化为人体胰岛素的方法，这种前体的化学式为式中R是氢、用化学的或酶促的方法可切开的氨基酸残基，或者用化学的或酶促的方法可切开的至少含有两个氨基酸残基的肽部分；R1是OH、Arg-Y，或Lys-Y，其中Y是OH、氨基酸残基，或者至少含有两个氨基酸残基的肽部分；从A-1至A-21部分是人体胰岛素A链；从B-1至B-30部分是人体胰岛素A链；从B-1至B-30部分是人体胰岛素B链；以及X是与胰岛素A链上A-1的氨基和胰岛素B链上B-30的羧基相连接的部分，这部分可以被酶促地从A链或B链上切开而且不破坏A链和B链，它包括在水介质中用胰蛋白酶和羧肽酶B处理这种人体胰岛素前体，该水介质含每摩尔人体胰岛素前体约0.1至10摩尔1种或多种具有原子序数21至34、39至52、57至84和89至92的金属离子。2.根据权利要求1的方法，其中金属离子是选自金属铬、钼、钨、汞、锑、铋、镍、铁、钴、锌、镉、铜、锡、铅、铕、铀、铂和锰的金属离子。3.根据权利要求2的方法，其中金属离子是选自金属镍、铁、钴、锌、镉、铜、锡、铅、铕、铀、铂或锰的金属离子。4.根据权利要求3的方法，其中金属离子是选自金属镍、锌、钴和镉的金属离子。5.根据权利要求1至4之任一项所述方法，其中人体胰岛素前体在水介质中的浓度可高达20毫克分子左右。6.根据权利要求5的方法，其中人体胰岛素前体在水介质中的浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：布鲁斯希尔弗兰克，里查德尤金海尼，沃尔特弗朗西斯普劳蒂，马克罗伯特沃尔登，
申请(专利权)人：伊莱利利公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]