生产Ｌ-谷氨酸的方法技术

描述了一种生产Ｌ－谷氨酸的方法，该方法包括在一种培养基中培养一种棒杆菌属或短杆菌属（ｇｅｎｕｓＣｏｒｇｎｅｂａｌｔｅｒｉｕｍ或Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）对线性短杆菌肽具有抗性并具有产生Ｌ－谷氨酸能力的微生物，Ｌ－谷氨酸在培养物中累积，再由其中回收Ｌ－谷氨酸。（*该技术在2009年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种通过发酵生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是一种作为食品添加剂或其他用途的重要的氨基酸。关于通过发酵生产L-谷氨酸的方法，到目前为止，已知的方法是使用属于棒杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)的野生型菌株，和棒杆菌属或短杆菌属的突变菌株。它们为自身的生长，需要各种化合物或对各种化合物具有抗性。在美国专利4，729，952号中描述了一种方法，该方法采用一种对能抑制能量代谢的抗生素或泛醌生物合成的前体具有抗性並有能力生产L-谷氨酸的微生物，以及采用一种对α-萘喹啉具有抗性並有能力生产L-谷氨酸的微生物，该专利还指出作为抑制能量代谢的抗生素是寡霉素，抗霉素A、鲁塔霉素、缬氨霉素和短杆菌肽S、短杆菌肽S是一种环状十肽菌素抗生素。本专利技术主要的目的是提供一种低廉的工业化的L-谷氨酸生产方法。根据本专利技术，L-谷氨酸的生产可通过在培养基中培养属于棒杆菌属或短杆菌属的微生物，它们对线性短杆菌肽具有抗性。並具有生产L-谷氨酸的能力，培养直至L-谷氨酸在培养液中累积，再回收其中的L-谷氨酸。任何一种微生物都可用于本专利技术，只要它属于棒杆菌属或短杆菌属，並对线性短杆菌肽具有抗性和有能力生产L-谷氨酸。可用于本专利技术的线性短杆菌肽，提及了短杆菌肽A、B、C、D及其混合物。尤其是包含短杆菌肽A、B和C的短杆菌肽D(Dabos)是最佳的。本专利技术突变株的获取可通过赋于能生产L-谷氨酸的棒杆菌属或短杆菌属的微生物对线性短杆菌肽以抗性，或通过另外的方法赋于对线性短杆菌肽具有抗性的棒杆菌属或短杆菌属微生物以生产L-谷氨酸的能力。合适的突变株能通过常规致突变方法制备，例如X-射线照射、紫外线照射、钴照射以及用化学突变剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍进行处理。所需要的突变株的分离是通过在含有线性短杆菌肽的固体培养基上培养如上所说的常规的致突变方法获得的菌株，在该固体培养基中线性短杆菌肽的含量是使亲代菌株不能在它上面生长的量，收集有能力在此固体培养基上生长的菌株，並选择一个有能力产生L-谷氨酸並且生产率大于亲代菌株的菌株。获取适当菌株的步骤具体例子如下产生L-谷氨酸的Corynebacterium glutamicum ATCC 13032经过200mg/l N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍于30℃下处理30分钟。处理过的菌株涂布于含10μg/ml线性短杆菌株肽最低培养基上〔10g/l葡萄糖，4g/l氯化铵、1g/l KH2PO4、3g/l K2HPO4、0.01g/l MgSO4.7H2O、0.01g/l FeSO4.7H2O、0.01g/l MnSO4.4-6H2O、2g/l脲、50μg/l生物素、20g/l琼脂、pH7.2〕，並于30℃下培养2-6天，然后收集在培养基上生长的线性短杆菌肽-抗性突变性的克隆，Sigma公司商售的线性短菌肽(商品名GramicidinD或GramicidinNF)可用于本专利技术。挑选出50个具有短杆菌肽-抗性的菌株，在这些菌株中进行L-谷氨酸的培养试验，从而选择出具有的生产L-谷氨酸能力在产率上高于其亲代菌株的菌株。作为这类菌株有代表性的实例已提到的有CorynebacteriumglutamicumH-7110(下文称为H-7110菌株)、该菌株已按布达佩斯条约自1988年5月11日以FERMBP-1876号寄存于日本工业科学技术厅发酵研究所(FRI)。当培养是在具有下列成分的最低琼脂培养基上30℃下振荡24小时时，短杆菌肽D-抗性菌株(H-7110)的生长度列于表1。最低琼脂培养基的成分。10g/l葡萄糖，0.4g/l MgSO4.7H2O、1g/lNH4CL、2g/l脲、1g/l KH2PO4、3g/l K2HPO4、10mg/l FeSO4.7H2O、4mg/l MnSO4.4H2O、5mg/l烟酸、1mg/l硫胺素盐酸盐、50g/l生物素、1ml/l痕量元素＊、20g/l琼脂(pH7.2)。＊痕量元素组分990mg/l FeSO4.7H2O、880mg/l ZnSO4.7H2O、393mg/l CuSO4.5H2O、72mg/l MnCL24-6H2O、88mg/l Na2B4O7.10H2O、37mg/l(NH4)6MO7O24.4H2O表1浓度ATCC13032H-7110GramicidinD0++++1μg/ml±++5μg/ml±++10μg/ml-++50μg/ml-+GramicidinS1μg/ml++++5μg/ml+±10μg/ml--++;充分生长，+;生长±;未完全生长，-，不生长。正如由表1结果明显地看到的那样，H-7110菌株对短杆菌肽S无抗性。任何合成的或天然的培养基都能用于本专利技术，只要它能适当地含有碳源，氮源，无机物和其它能为所用菌株同化的营养物。也就是作为碳源可使用碳水化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖;糖醇如甘油和山梨醇、淀粉和淀粉水解物以及糖蜜都能使用，以及有机酸如乙酸、丙酮酸、乳酸、富马酸、葡糖酸等;氨基酸如天冬氨酸等;以及低级醇类如乙醇等都能使用。作为氮源可使用氨;无机和有机铵盐如氯化铵、硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、乙酸铵等;氨基酸如天冬氨酸等;脲和含氮的化合物类如胨、肉提取物玉米浆、酷蛋白水解物，大豆水解产物等。作为无机化合物，可使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、碳酸钙等。如果需要，微生物生长必须的维生素如生物素，烟酰胺、泛酸、硫胺素等都可以加在培养基中，然而，假若维生素类能与其它如上述用于培养基的成分一块提供的话，添加这些维生素就没有必要了。在需氧条件下进行培养，例如采用振动培养，搅拌浸没培养等，温度为20-40℃，pH为3-9，推荐pH接近中性、培养基的pH可用碳酸钙，有机或无机酸类，碱溶液，氨、pH缓冲液类等进行调节，通常，培养1-4天后L-谷氨酸能在培养物中累积。如现有技术中已知的，生物素量应保持低浓度以使累积的L-谷氨酸质量得以提高。在所使用的培养基含有大量生物素量情况下，可在该培养基中加入表面活性剂、青霉素等。在培养完成后，先从培养物中除去沉淀物如细胞，再用已知方法回收其中的L-谷氨酸，所用方法如离子交换，树脂处理法、浓缩法、吸附与盐析结合法。实施本专利技术具体实施例通过下列有代表性的实施例加以说明。例1作为接种菌株，使用Corynebacterium glutamicum H-7110(FERM BP-1876)、H-7110菌株用振动法在250ml Erlenmeyer烧瓶内培养24小时，该瓶内含有由40g/l葡萄糖，5g/l酵母膏、1.5g/l KH2PO4、0.5g/l K2HPO4、0.5g/l MgSO4.7H2O、100μg/l生物素和3g/l脲组成的20ml接种培养基，其pH为7.2然后，用此法获得的1ml接种培养物再接种到250mlErlenmeyer烧瓶内采用振动法于30℃下培养24小时，该瓶含有如下成分的20ml发酵培养基。所产生的L-谷氨酸的量为28.7g/l，为了对照，除使用亲代菌株、ATCC-13032菌株作为接种菌株外，重复上述步骤，所获得的L-谷氨酸为24.4g/l另外，以类似于制备本专利技术线性短杆菌肽-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产Ｌ—谷氨酸的方法，其特征在于该法包括在一种培养基中培养对线性短杆菌肽具有抗性和具有产生Ｌ—谷氨酸能力的棒杆菌属或短杆菌属的微生物，直到Ｌ—谷氨酸在培养物中累积，再从其中回收Ｌ—谷氨酸。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：古川令，石村正利，中西俊秀，
申请(专利权)人：协和发酵工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]