粒细胞菌落刺激因子的突变蛋白制造技术

一种粒细胞刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）或一种不同于天然Ｇ－ＣＳＦ的Ｇ－ＣＳＦ变异体，其中：在有１７４氨基酸的成熟Ｇ－ＣＳＦ的５０至５６位的序列或有１７７氨基酸成熟Ｇ－ＣＳＦ的５３至５９位上序列中的一个或几个氨基酸或／和：在有１７４氨基酸的４３；７９；１５６或１７０位上或有１７７氨基酸的４６；８３；１５９或１７３位上的４个组氨酸残基中的至少一个被诱变。它适于免疫治疗。（*该技术在2011年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及在含174氨基酸的成熟粒细胞刺激因子G-CSF的50到56位点上在序列50 51 52 53 54 55 56Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile中或在含177氨基酸的成熟G-CSF-的53到59位点上或/和在含174氨基酸的成熟G-CSF的43，79，156和170位点上或在含177氨基酸的成熟G-CSF的46，82，159或173位点上的至少4个His残基中的一个发生突变的粒细胞刺激因子G-CSF的突变蛋白。淋巴因子与血细胞的成熟有关。它们刺激骨髓干细胞成熟成为完全分化细胞。G-CSF是由活化的单核白细胞、巨噬细胞及一系列其他细胞系合成的。已经将G-CSF从人膀胱癌细胞系5637的细胞培养上清液中纯化为同质型(Welte et al.，Proc.Natl.Acad.Sci 82(1985)，1526).编码天然G-CSF的cDNA序列已从Sunza et al.，Science 232(1986)，61中得知。作为在第二基因内区可变拼接的结果，G-CSF的两个自然发生区与前30个氨基酸代表一个信号肽的204或207个氨基酸同时存在，(Lymphokines，IRL Press，Oxford，Washington D.C.，Editors D.Male and C.Rickwood)，这种天然蛋白质的分子量大约为19.6KD，并有5个能形成分子内或分子间二硫键的半胱氨基残基，结合研究表明，G-CSF与中性粒细胞结合，与红血球、淋巴嗜酸性细胞系以及与巨噬细胞没有观察到或只观察到有微弱的结合，G-CSF受体由一个分子量为150KD的单肽链组成(Nicola，Immunol.Today 8(1987)，134)，每个细胞的受体数通常随细胞的成熟而增加并能达到每个细胞数百个。据推测，淋巴因子受体是由一个结合配体细胞外区、一个疏水运输膜区以及一个细胞内区组成。淋巴因子与其受体的结合能导致环核苷酸的合成，4，5-二磷酸磷脂酰肌醇酯的水解以及蛋白激酶C的活化和细胞内钙水平的提高。有趣的是这些过程如何影响细胞的代谢，但目前仍很难理解，配体与它的受体结合的进一步的结果是通过一种受体依赖的细胞内吞作用，将受体一配体复合体迁移到细胞内。显然淋巴因子(即G-CSF)也发生这种类型的内化，然而，细胞代谢的结果仍不清楚。由于G-CSF能够在短时期内，大量提高中性粒细胞的数量，可考虑把G-CSF用于治疗学领域，因此，G-CSF可能用于例如癌化学疗法后，免疫系统的细胞被破坏。另外G-CSF能用于骨髓移植、严重的灼伤、因免疫缺失而引起的机会致病菌的感染以及白血病，为了不同类型的治疗有必要发展高活性和低活性型的G-CSF。本专利技术的目的是通过点突变的特点特异导入而发展具广谱活性的G-CSF分子。在这一过程中，活性的改变将通过尽可能小的氨基酸序列的改变来达到。本专利技术的目的是通过对粒细胞刺激因子(G-CSF)或G-CSF变异体，在有174个氨基酸的成熟G-CSF的Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile序列中的50到56位点上或在有177氨基酸的成熟G-CSF的53到59位点上的一个或几个氨基酸进行诱变处理或/和对174氨基酸的成熟G-CSF的43，79，156或170位点上或177氨基酸的成熟G-CSF46，82，159或173位点上，4个组氨酸中的至少一个进行诱变处理而达到的。新氨基酸的意外导入产生了有广谱活性的G-CSF突变蛋白。活性的测定可按照例如Biochem.J.253(1988)213-218;Exp.Hematol.17(1989)116-119;Proc.Natl.Acad.Sci.USA83(1986)5010完成。按照本专利技术，术语G-CSF或G-CSF变异体包括所有有或没有前导序列的G-CSF的自然产生的变异体以及通过DNA重组技术修饰从它衍生出的G-CSF蛋白质。特别是除G-CSF部分外还含有多聚肽序列的融合蛋白质。在这种意义上，G-CSF突变蛋白优选的是在位置-1上带有N末端Met残基，以适合在原核细胞中表达。另外优选的是一个重组体，即能按照PCT/EP91/00 192生产的甲硫氨酸一游离的G-CSF变异体。术语“诱变处理”是指使有关的氨基酸缺失或最好是被其他氨基取代。在这种意义上，G-CSF突变蛋白优选的是在其中序列Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile的7个氨基酸中的一个被其他氨基酸取代。不过也可取代多于一个特别是两个氨基酸。一个G-CSF突变蛋白特别优选的是在有174个氨基酸的成熟G-CSF的53位上的Ser残基，或有177个氨基酸的成熟G-CSF的56位上的Ser残基被基他19种氨基酸中的一种，特别是被Thr取代。另外，优选的是在具有174个氨基酸的成熟G-CSF的54位上或具有177个氨基酸的成熟G-CSF的57位上的Leu残基，被19种其他氨基酸中的一种，特别是被Thr取代，通过这种方法，可以获得有G-CSF活性的广泛变异的G-CSF突变蛋白。另外，G-CSF突变蛋白优选的是在具有174个氨基酸的成熟G-CSF的43，79，156，或170位点上或有177个氨基酸的成熟G-CSF的46，82，159或173位点上的4个His残基中的一个被其他氨基酸特别是Gln取代。本专利技术也提供了编码了本专利技术G-CSF突变蛋白的一个重组DNA，本专利技术还提供了含有本专利技术的重组DNA至少一个拷贝的重组载体，在这方面，重组载体优选的是适合于在原核细胞中基因表达的重组载体。这种类型的载体是本领域专业人员熟知的。另外本专利技术提供了一个用本专利技术的一个重组DNA或/和本专利技术的重组载体转化的细胞，这种细胞优选的是原核细胞，特别是E.Coli细胞。本专利技术也提供了一个用于生产本专利技术的重组DNA的方法，在该方法中一个编码了G-CSF或G-CSF变异体的DNA系列被位点特异地诱变，用于位点特异诱变的分子生物学方法是本领域技术人员熟知的，诱变最好是通过在作为模板的单链DNA上使用作为诱变引物的合成寡核苷酸完成，普通方法例如被描述在Amersham No.1523“Oligonu-cleotide-directed in vitro mutagenesis system”;Mechods in Enzymology(Academic Press，Inc.Vol.154，Part E，367-382(1987);Analytical Biochemistry 179(1989)309-311。另外，本专利技术提供了一个用于生产本专利技术的G-CSF突变蛋白的方法，其中，一个细胞被用本专利技术的重组DNA或/和本专利技术的重组载体转化，被转化后的细胞在合适的培养基中培养并从细胞或培养基中分离该蛋白质，常用的从真核或原核细胞分离重组蛋白质的分子生物学方法是本领域专业人员熟知的，不需详细说明。最后，本专利技术还提供了一种基于以本专利技术的G-CSF突变蛋白药物制剂为活性物质的药物制剂，如果需要，还含有常用的药用载体，填充剂和辅助物质，这样的药物制剂特别适于本申请上述提到的治疗领域，并进一步适于刺激中性粒细胞形成的治疗过程。下列的实施例打算说本文档来自技高网...

【技术保护点】
粒细胞刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）或Ｇ－ＣＳＦ变异体，其中，有１７４氨基酸的成熟Ｇ－ＣＳＦ的５０到５６位上序列＊＊＊中或有１７７氨基酸的成熟Ｇ－ＣＳＦ的５３到５９位上的序列的一个或几个氨基酸或／和有１７４个氨基酸的成熟Ｇ－ＣＳＦ的４３，７９，１５６或１７０位点上或在有１７７个氨基酸的成熟Ｇ－ＣＳＦ的４６，８２，１５９或１７３位点上的４个组氨酸残基中至少一个被诱变。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：冈瑟舒马赫，卡罗拉多尼，
申请(专利权)人：伯伦格曼海姆有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]