启动转录调控核苷酸序列制造技术

本发明专利技术涉及一种重组核苷酸序列，其特征是，它包括：一个启动转录调控序列，这个调控序列含有一个与结构ＧＣＡＣＴＣ９ＮＧＡＧＴＧＣ联接的启动子，其中“Ｎ”表示四个基团：胸腺嘧啶，鸟嘌呤，腺嘌呤和胞嘧啶中的任何一个；一个多肽的编码序列，称做“异源多肽”，它不同于自然状态下与上述启动子联接的序列。所述编码序列位于所述启动转录调控序列的后部，在适当条件下，该位置使得多肽的表达可在上述启动子的控制之下进行。（*该技术在2011年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及启动转录的调控核苷酸序列及其在重组法生产多肽中的应用。本专利技术研究中所提出的技术问题是识别一种强力的并且最终是可热诱导的启动子，它可以用于多种微生物，特别是可用于放线菌类。鉴于放线菌中包括了链霉菌和分枝杆菌，使得放线菌成为一类具有重要经济意义和医学价值的微生物。目前在抗生素的商品生产中，大约有70%使用了链霉菌，此外，如果说结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌的危害性不再被强调，但是为了获得活的多价疫苗菌株，在牛分枝杆菌(M.bovis)BCG菌株中提取异种抗原仍有很大的价值。在分子水平上对这些菌种的基因遗传学研究还很少，它们的基因表达调控与研究较多的一些菌如埃希氏大肠菌或枯草杆菌等表达调控是不同的。尤其是DNA富含G+C(鸟嘌呤+胞嘧啶)的放线菌对埃希氏大肠杆菌或枯草杆菌中特征“启动子”序列的识别能力较小和较差。Baird等人(J.Gen.Microbiol.1989，135，931-939)研究了分枝杆菌中热冲击蛋白质中的编码基因，并且假设，两种序列TTGAG和TCTCATGT，(它们出现在结核分枝杆菌中的10kDa，热冲击蛋白质的编码序列的前部)组成了启动子的-35和-10区域。事实上，这两个序列呈现出与埃希氏大肠杆菌中的相应启动子的序列高度的同源性。此外，那些出现在各种分枝杆菌中的其它热冲击蛋白质(例如，麻风分枝杆菌的65kDa蛋白质或牛分枝杆菌的64kDa蛋白质)的编码基因前部的序列同样也包含了一对同样类型的序列，即TTGCCG和TTTCAT，或者TTGCCG和CTTCAT，因此它们与埃希氏大肠杆菌的启动子以及10kDa结核分枝杆菌的“-35及-10”序列有高度的同源性。按照该论文以及Thole等人的论文(Infection and immunity，55 1987，1466-1475)，对分枝杆菌中热冲击蛋白质基因的转录起作用的启动子中包含了这种类型的序列(作为序列-35和-10)。以下把这种序列称为“埃希氏大肠杆菌型-35和-10序列”。这样，这些，作者还没有从结构带上证实这个假设，从而对启动子的辨认也还没有确定。令人惊奇地是本专利技术的专利技术者已经证明，埃希氏大肠杆菌型-10和-35序列同样出现在链霉菌之中，但是它们在这些菌中并不起热冲击蛋白质转录的启动作用。应该提及在上面所引述的论文中，Baird和Thole还证明了在分枝杆菌中热冲击蛋白质的编码基因前部的序列中，存在着一种含有序列GCACTC 9N GAGTGC的回文顺序结构。然而，这个结构的确切作用尚未确定。Thole假设，这个结构或者涉及到出现在热冲击蛋白质编码基因前部的操纵子(operon)转录的末端，或者涉及到多顺反子信使的译码规律。为了克隆出一种可用于大量放线菌的强力的启动子，(并且最终是可热诱导的)，本专利技术者研究了链霉菌中热冲击的应答，并且克隆了一种强力表达的蛋白质，以便确定其启动子的特性。事实上，对通过重新合成蛋白质得到的热冲击的应答现象是一种普遍现象;所以人们可次预言，其规律对各种放线菌应该是相似的，特别是具有相同序列的启动子可以用于大量的菌株。本专利技术者还在链霉菌中鉴定了两种功能性的启动子，并确定了它们的特性，由于观察到了这两个启动子都含有GCACTC 9N GAGTGC结构，从而确定了该结构的功能。本专利技术涉及一个重组的核苷酸序列，其特征为一个启动转录调控序列，这个调控序列含有一个与结构GCACTC 9N GAGTGC联接的启动子，其中的“N”代表下述四个碱其中的任一个T-胸腺嘧啶，G-鸟嘌呤，A-腺嘌呤，C-胞嘧啶;一个多肽的编码序列，称为“异源多肽”它不同于自然状态下与上述启动子联接的序列，其编码序列位于所述启动转录调控序列的后部，在适当条件下，该位置使得多肽的表达可以在上述启动子控制下进行。本专利技术的重组核苷酸序列使得能够在含有异源基因的细胞中表达异源基因。启动转录调控序列(它是重组核苷酸序列的一部分)是由一个与结构GCACTC 9N GAGTGC相联的启动子所组成的。这里，“相联”是指，结构GCACTC 9N GAGTGC可以不同于启动子，或者该结构可能被包含在(至少部分地被包含在)启动子中。这后一可能性同时包括了两种情况，一种情况是该结构重叠在启动子序列上，另一种情况是该结构组成了启动子整体的一部分。本专利技术特别推荐的与结构GCACTC 9N GAGTGC相联的那些出现在放线菌中的启动子，在细菌基因组中，它们通常与热冲击蛋白质相联。作为这类启动子的例子，可以举出白色链霉菌中的18kDa(P1)和56kDa(P2)热冲击蛋白质启动子，在本专利技术者的专利技术范围中将它们识别为P1对应于下两序列之一 P2对应于下两序列之一 这些启动子中的任一个都可以在5′端缩短最多4或5个碱基，而不会损害其活性。另外类型的启动子是那些在10kDa和65kDa结核分枝杆菌在64kDa牛分枝杆菌中的和65kDa麻风分枝杆菌中的热冲击蛋白质启动子。结构GCACTC 9N GAGTGC与启动子的联连给启动子以热诱导的特性。这个结构有可能是一个操纵子(operateur)，并组成一个阻遏蛋白(represseur)的固定位置，从而阻止RNA多聚酶结合在启动子的-10和-35序列上。在该结构和启动子分离的情况下，它倾向选择在启动子的前部，例如大概150至200个碱基处。本专利技术的重组序列包括(除了启动转录调控序列外)一个多肽的编码序列，称“异源多肽”，它不同于自然状态下与上述启动子联接的序列。这样，启动子直接处在基因环境之中，与包围在产生启动转录活性的基因组之中的情形不同。作为异源多肽类型的例子，可以举出用于生产重组活疫苗的中和抗原，或者对抗生素以抵抗力的多肽，酶，等等。在本专利技术的核苷酸序列中，编码序列位于所述调控序列的后部。当然，它们的相对位置是这样的即编码序列的表达在启动子的控制之下发生。本专利技术此外还涉及一个表达载体，例如质粒，它包含本专利技术的核苷酸序列。本专利技术同样还包括一个由该表达载体所转化的细胞，所述细胞能够识别启动转录调控序列的启动子，表达多肽。转化细胞是原核生物细胞，特别是属于放线菌类(例如链霉菌或分枝杆菌)的原核生物细胞。本专利技术还涉及一个生产多肽的方法，其特征是它包含了以下步骤-根据本专利技术，利用表达载体，在允许所述多肽表达的条件下，进行细胞转化，由表达载体所转化的细胞能够识别上述启动子;-回收所表达的多肽。允许多肽表达的条件在现有技术中是已知的，在目前情形中它包括最好是热冲击的使用，它具有诱导表达的作用。热冲击可以是提高温度，达到大约37-45℃，尤其是40℃至45℃，例如对链霉菌是37℃或41℃，对于分枝杆菌是42℃至45℃。值得注意，利用本专利技术的启动子P1和P2将导致在高温下(例如对于链霉菌在37℃和41℃之间)能维持异源蛋白质的表达。本专利技术的另一方面涉及到这样的可能性，即通过把一种启动子与结构GCACTC 9N GAGTGC相结合，使之转化成可热诱导的启动子。更特殊地，本专利技术的这个方面涉及到一种方法，该方法能赋于启动子以热诱导特性，其特征是两个一个是含有结构GCACTC 9N GAGTGC的序列，另一个是启动子含有结构GAGTC的序列位在启动子的前部，或者把含有结构GACTC 本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组核苷酸序列，其特征是，它包括：一个启动转录调控序列，这个调控序列含有一个与结构ＧＣＡＣＴＣ９ＮＧＡＧＴＧＣ联接的启动子，其中“Ｎ”表示四个基团：胸腺嘧啶，鸟嘌呤，腺嘌呤和胞嘧啶中的任何一个；一个多肽的编码序列，称做“异源多肽”， 它不同于自然状态下与上述启动子联接的序列，所述编码序列位于所述启动转录调控序列的后部，在适当条件下，该位置使得多肽的表达可在上述启动子的控制之下进行。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅佐迪尔菲利普，古格埃尔米热拉尔，
申请(专利权)人：巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：FR[法国]