重组马立克氏病病毒制造技术

本发明专利技术涉及使用马立克氏病Ｉ型病毒作为能在某些家禽中表达外来基因的病毒载体。要求专利保护的是该病毒之ＤＮＡ基因组上的非必须插入区域、含有该区域的质粒、包含该质粒的宿主细胞，以及含有重组病毒的疫苗。（*该技术在2011年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及能够表达外来基因，特别是鸡的外来基因的病毒载体。具体地说，本专利技术涉及马立克氏病病毒(MDV)血清型1DNA基因组的插入区域的发现，该区域内可插入一个包括侧翼接有来自该插入区域DNA序列之外来基因的异源核酸序列;含有所说核苷酸序列的质粒;含有重组MDV的疫苗;以及含有抗重组MDV抗体的抗血清。马立克氏病是一种由疱疹病毒即马立克氏病病毒引起的鸡的恶性淋巴组织瘤性疾病。该病毒感染鸡并在感染后几周内发展成各组织的T细胞淋巴瘤，最终导致被感染的鸡死亡或成为进行性恶化的不治之症。这种疾病在疱疹病毒诱发的疾病中是独特的，在于近20年来，在美国和世界上许多其他地区，已因疫苗接种所有商品肉鸡和肉鸡饲养员而在家禽工业中得到了控制。MDV是一种有包膜的DNA病毒并在分类学上分在疱疹病毒科(Herpesviridae)。进一步可分为下列三个血清型Ⅰ型对鸡有致病性和致肿瘤性的MDV强毒力株，以及由之衍生的减毒非病原性病毒株;Ⅱ型天然存在的MDV非致病性病毒株;以及Ⅲ型对鸡无致病性的火鸡疱疹病毒株(HVT)。二十世纪中，一直在研究MDV感染的致病机理和MDV的传统病毒学问题。近十年来，对MDV的分子分析已取得进展。主要进展包括克隆病毒DNA分子(Fukuchi et al.，J.Virol.51102-109，1984)、产生抗MDV单克隆抗体、鉴定病毒多肽、得到转录图谱(Schat et al，Int.J.Can-cer 44101-109，1989)，以及鉴定MDV基因组上的基因(Buckmaster et al，J.Gen.Virol.692033-2042，1988)。虽然已报导了一个HVT的乙酸磷酰酯抗性突变株，但迄今为止还没有真正对该病毒进行过基因分析。马立克氏病是有极大经济重要性的疾病，而且有效的马立克氏病疫苗对于家禽养殖业的发展是十分关键的。最广泛使用的疫苗是HVT疫苗，不过近年许多地区也联合使用MDV疫苗。已有的马立克氏病疫苗已不可能满足未来家禽养殖工业的需求，发展重组马立克氏病疫苗仍是对该领域内研究人员的一个严重挑战。因为已有马立克氏病疫苗作为活的疱疹病毒疫苗已在家禽养殖业中使用了二十年，所以目前可将其作为适用于家禽的潜在疱疹病毒载体来研究。已报导的病毒载体中，如可使用牛痘病毒、乳头状瘤病毒、杆状病毒、细小病毒和烟草花叶病毒。所有已报导的这些病毒均可作为外来基因的克隆载体或表达载体。也已报导可用MDV作为外来基因的表达载体(见T.Iskikawa et al，欧洲专利申请0 334 530号)。其中述及可将外来基因，如编码血细胞凝集素和新城疫病毒(NDV)之神经氨酸苷酶的基因插入编码HVT之A抗原位点的基因(gp57-65基因)中。重组HVT被用于产生抗NDV和MDV的疫苗。在国际专利申请WO88/07088号中，S.Martin等人描述了将外来基因插入HVT的非必需区域并用该病毒载体感染鸡，以使之最终产生针对外来基因产物和HVT的免疫原性反应。特别是其中述及HVT是作为病毒载体的仅有的鸟类疱疹病毒，并且使用了编码胸苷激酶和1-β-D-阿胸苷抗性的非必需区域。Cochran等人在国际专利申请WO89/0140号中述及，可将外来基因插入病毒的疱疹病毒载体中。他们描述了包含与假狂犬病病毒gpX糖蛋白部分相融合之抗原性氨基酸序列的重组融合蛋白质。其中将编码VP2、VP4和PV3三个多肽之感染性腔上囊病病毒(IBDV)RNA大片段的CDNA拷贝和大肠杆菌β半乳糖苷酶基因插入HVT基因组之特有长区域内的非必需位点中。这种重组病毒被用作抗IBDV的疫苗。将MDVA抗原基因(gp57-65)插入HVT的同一位点，以产生改良的抗MDV疫苗。虽然已对某些疱疹病毒如单纯疱疹病毒和假狂犬病病毒作了基因分析，但还不了解MDV血清型1(MDV-1)之DNA基因组的遗传结构。目前使用的抗各种家禽疾病的疫苗多是使用活的、减毒的病原体生产的，因此存在用不足以减毒的病原性微生物接种动物的危险。失活的疫苗一般只诱导仍须追加免疫的低水平免疫力。此外，经灭活处理可使诱导中和作用病毒的抗原决定基发生改变，以致降低了疫苗的保护能力。如果在疫苗中合用一种以上减毒的活病原体，又可引起其他问题。抗原成分的相互影响可导致一种或多种组成抗原之免疫原性的降低。为了产生强有力的抗马立克氏病和至少一种其他鸟类疾病的疫苗。通过使用其中MDV的DNA基因组含有编码来自其他鸟类疾病致病因子之抗原的外来基因的MDV载体，就必须找到一个MDV基因组的非必需区域并用作插入区。一旦外来基因被插入到该插入区域内，便必定能表达相应的基因产物。一旦将MDV载体注入鸡体内，即可引发最好比联合疫苗表现出更大能力的抗MDV和外来基因产物(如一种蛋白质)的免疫反应。附图说明图1显示见于马立克氏病病毒血清型1(MDV-1)DNA基因组特有短区域内BamHI-A之末端4.3kb EcoRI-BamHI亚片段中开放读码的限制性酶切图。编号指示相当于图2中所示序列的核苷酸位置。所用缩写符号ORF-开放读码;B-BamHI;E-EcoRI;TR-1-独特的末端长重复区;IR-1-特有的长反向重复区;TR-s-特有的末端短重复区;IR-s-特有的长反向重复区。图2显示MDV-1插入区的DNA序列。图3显示含有克隆到质粒载体PUC19中的BamHI-A之末端BamHI-A中的4.3kb EcoRI-BamHI亚片段的质粒PMD100，该BamHI-A的4.3kb EcoRI-BamHI亚片段含有一个独特的BgeⅡ位点。图4显示含有由SV40早期启动子开始表达之lacZ基因(其可表达β半乳糖苷酶)的暗盒。图5显示含有从SV40早期启动子开始表达之lacZ基因的质粒pMT1A和pMT1B，前者被插入到位于BamHI-A之4.3kb EcoRI-BamHI亚片段内的BgeⅡ位点中。图6显示对得自GA亲代和GAlac重组MDV-1分离物之DNA所作Southern吸印分析的结果，表明重组是位点特异性的。图7显示亲代(GA亲代)和重组(GAlac 1)MDV-1分离物于37℃下的生长曲线。图8显示亲代(GA亲代)和重组(GAlac 1)MDV-1分离物在41℃下的生长曲线。本专利技术的主题是发现了此前未知的、MDV-1之DNA基因组上的非必需插入区域。该区域包含基因组特有短区域内的BamHI-A之末端4.3kb EcoRI-BamHI亚片段中的开放读码。BamHI-A是用BamHI完全消化MDV-1基因组后所得29个BamHI片段中最大的一个，且BamHI-A在酶切图上位于基因组的独有短区域内。该区域是由图1所示限制性酶切图限定的。该区域基本上包括了图2所示从核苷酸位置238到1050的DNA序列。另外，本专利技术包括了含有该插入区域的质粒。本专利技术还包括了含有外来基因，较好是编码另一个家禽疾病致病因子之免疫原的基因的重组MDV-1。因该重组病毒基因组中还插入了编码所说致病因子的外来基因，故可引发抗MDV和所述致病因子的免疫反应，从而可保护健康动物免受相应致病因子的感染。众所周知，可用抗特异性病原体的抗血清治疗已受该病原体感染的动物。本专利技术中，抗体是由重组MD本文档来自技高网...

【技术保护点】
马立克氏病病毒血清型１（ＭＤＶ－１）之ＤＮＡ基因组的插入区域，其包括基因组之独特短区域内末端４．３ｋｂ－ＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩ亚片段中的开放读码，并且具有基本上如图１所示的限制性酶切位点图。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：罗宾威尔逊摩根，
申请(专利权)人：阿克佐公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]