利用酵母菌转化制备木糖醇的方法技术

一种用单一微生物细胞转化木糖或木质素、半纤维素水解物制备木糖醇的方法，这种方法工艺简单、成本低、产率高，对于用廉价原料生产木糖醇具有实际意义。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及木糖醇的制备方法木糖醇是一种甜度与蔗糖相当的天然甜味剂。由于它在人体代谢中不依赖胰岛素并有抗龋齿作用，因此是糖尿病与牙病患者理想的蔗糖替代物。它存在于一些水果和蔬菜中，由于含量太低，提取很不经济。目前主要用木糖催化加氢的方法制备(Wisnik，J.etalInd.Eng.Chem.Prod.Res.Dev.，3232-236，1974)。但这种方法需要用纯木糖为原料，因此工艺复杂，成本很高，限制了木糖醇的大量应用。为了用廉价的原料如木质素、半纤维素水解物来生产木糖醇，已有不少研究涉及利用微生物发酵的制备方法(Roberto，L.C.etalBioresourseTechnol.36271-275，1991)由于这些水解物中含有抑制微生物生长的物质，因此发酵这些水解物制备木糖醇的产率不高，即使进行了预处理也提高不大(Dominguez，J.M.etalAppl.Biochem.Biotechnol.57/5849-56，1996)。木质素和半纤维素水解物的主要成份是木糖，从木糖到木糖醇的生化反应是 许多微生物细胞有木糖还原酶，因此可以通过发酵得到木糖醇。为了避免水解物中一些成份对细胞生长的抑制，也可以用细胞转化的方法制备木糖醇，但还必须考虑辅酶的问题，一般需要两种微生物细胞，并且反应条件也十分复杂，难以实际应用(Nshio，M.etalJ.Ferment.Bioengin.67356-360，1989)。本专利技术是选育了一株具有独立转化木糖为木糖醇能力的酵母菌(异常汉逊酵母Hansenula anomala)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册的编号为CGMCC0274。微生物菌种保藏管理，细胞培养后，用游离细胞或固定化细胞都可以转化木糖或木质素、半纤维素水解物为木糖醇。将保存在斜面培养基(2％葡萄糖，1％酵母膏，1％蛋白胨，2％琼脂，自然pH)上的酵母菌接于液体培养基(木糖0.1-5.0％，酵母膏1％，蛋白胨0.5％，pH4.8)中，在24-37℃振荡培养，培养时间可控制在8-96小时之间，以24-48小时为最佳，然后冷冻离心收集、洗涤细胞。直接使用或将细胞固定化，与木糖溶液反应。反应温度范围可以为18-58℃，以25-40℃最佳；反应时间可以控制在12-200小时之间，最佳反应时间为24-120小时。反应液中木糖转化为木糖醇，转化率60-70％。由于细胞已经培养好，因此在以木质素、半纤维素水解物为底物时，不存在抑制生长的问题，产率较高。并且转化反应的系统比发酵培养基简单得多，因此产物的分离纯化也相对简单。固定化细胞还能反复使用多次，可进一步节省培养细胞的费用并简化了工艺。这是一种可以利用廉价原料生产木糖醇的有实际意义的制备方法。实施例1游离细胞转化木糖为木糖醇(1).将所用酵母菌接一环于液体摇瓶培养基中(D-木糖1％，酵母膏1％，蛋白胨0.5％，pH4.8，20ml培养基/250ml摇瓶)在温度为30℃、220rpm培养36小时后离心收集菌体(BECKMAN GS-15R，F0630，8000rpm，10℃，10min)用生理盐水10ml洗涤菌体2次，离心取菌体。(2).用200ml蒸馏水悬浮菌体，将菌悬液转入250ml三角瓶，称取2gD-木糖置于上述三角瓶中，用纱布封住瓶口，于旋转摇床上进行转化(转化温度在18℃-58℃，但30℃转化效果最好，220rpm)，96小时后取样用TCL检测样品，并以D-木糖和木糖醇为标样，结果D-木糖完全转化为木糖醇。测定反应液中木糖醇的含量并计算反应转化率为70％。实施例2游离细胞转化木屑水解物(1).将所用酵母菌接一环于液体摇瓶培养基中(D-木糖1％，酵母膏1％，蛋白胨0.5％，pH4.8，20ml培养基/250ml摇瓶)在温度为30℃、220rpm培养36小时后离心收集菌体(BECKMAN GS-15R，F0630，8000rpm，10℃，10min)用生理盐水10ml洗涤菌体2次，离心取菌体。(2).称取50g木屑，加2％硫酸溶液至500ml体积，80℃水浴保温12小时进行水解。用CaOH中和水解物至pH＝6.0，待CaSO4充分析出后抽滤除去沉淀，得木屑水解液，其中D-木糖含量约为0.7％。(3).取上述水解液30ml悬浮本例(1)所述的菌体转入250ml三角瓶中，纱布封口，于摇床上进行转化(30℃，220rpm)，48小时后取样，用TCL分析，已转化完全，只有木糖醇的斑点，测定反应液中木糖醇含量并计算反应转化率为60％。实施例3固定化细胞转化D-木糖为木糖醇(1).将所用酵母菌接一环于液体摇瓶培养基中(D-木糖1％，酵母膏1％，蛋白胨0.5％，pH4.8，20ml培养基/250ml摇瓶，共计四瓶)在温度为30℃、220rpm培养36小时后离心收集菌体(BECKMAN GS-15R，F0630，8000rpm，10℃，10min)用生理盐水10ml洗涤菌体2次，离心取菌体。(2).称6g海藻酸钠，加94ml蒸馏水加热使其溶解，待用。(3).用7.0ml蒸馏水悬浮菌体，加7.0ml溶液(2)(冷至40℃)，充分混匀。将此液体吸入注射器中呈滴状滴入2％CaCl2液体中固化。滴完后将装有CaCl2的烧杯置于冰箱中继续固化10小时。用砂芯漏斗将固定化细胞颗粒滤出，用蒸馏水洗涤3次，得固定化细胞。(4).于250ml三角瓶中称取2gD-木糖，加20ml蒸馏水，将本例(3)所述的固定化细胞转入三角瓶中，纱布封口，于摇床上转化(30℃220rpm)，120小时后用TCL检测已转化完全。测定反应液中木糖醇含量并计算反应转化率68％。实施例4固定化细胞转化木屑水解物(1).如实施例3(1)，(2)，(3)得固定化细胞。(2).如实施例2(2)得木屑水解液。(3).于250ml三角瓶中加30ml水解液，与固定化细胞混合后，用纱布封口，在摇床转化(30℃，220rpm)，48小时后用TCL检测，已转化完全。测定反应液中木糖醇含量并计算反应转化率为59％。权利要求1.一种制备木糖醇的方法，其特征在于用酵母菌细胞转化底物的方法进行制备。一种按照权利要求1所述的制备木糖醇的方法，其特征在于制备方法依次包含下述步骤(1).微生物经诱导培养后收集细胞。(2).将细胞或固定化的细胞与底物进行生化反应后即得到木糖醇。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所用的酵母菌为异常汉逊酵母(Hansenula anomala)。3.如权利要求1(1)所述的方法，其特征在于酵母菌诱导培养是指培养物中要加0.1-5.0％的木糖，最适用量为1％。4.如权利要求2所述的酵母菌细胞，其特征在于游离细胞或固定化细胞。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所用的底物为木糖或木质素、半纤维素水解物。6.如权利要求1所述的细胞培养过程，其特征在于培养温度为24℃-37℃，最适温度为28℃-32℃。7.如权利要求1所述的细胞培养过程，其特征在于培养时间为8-96小时，以24-48小时范围内培养结果为最佳。8.如权利要求1所述的生化反应，其特征在于反应温度为18℃-58℃，反应温度为25℃-40℃最佳。9.如权利要求1所述的生化反应，其特征在于反应时间可本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备木糖醇的方法，其特征在于：用酵母菌细胞转化底物的方法进行制备。一种按照权利要求１所述的制备木糖醇的方法，其特征在于制备方法依次包含下述步骤：（１）．微生物经诱导培养后收集细胞。（２）．将细胞或固定化的细胞与底物进行生化反 应后即得到木糖醇。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：江宁，贺鹏，孙万儒，卢大军，张博润，强亚静，杨柳，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]