酵母中核黄素的过量生产制造技术

本发明专利技术提供一种酵母菌株，此酵母菌株已用包含编码至少一种具核黄素生物合成活性的多肽并在适当寄主中表达的ＤＮＡ序列的重组ＤＮＡ序列转化，所述ＤＮＡ序列在这种酵母菌株中与有功能的启动子可转录地相连。本发明专利技术也提供核黄素的生产方法，其特征在于在适当培养条件培养上述酵母菌株以及从培养基或酵母菌株分离合成的核黄素；以及食品或饲料组合物的生产方法，其特征在于将获得的核黄素与一种或多种适当食品或饲料成分混合。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
核黄素的衍生物〔黄素辅酶(flavocoenzyme)FMN和FAD〕是所有细胞生物中氧化还原反应普遍必需的。核黄素(维生素B2)由所有植物和许多微生物合成。核黄素不能在脊椎动物中合成，因此核黄素是动物和人必需的营养物。核黄素可以通过化学方法合成，也可以使用芽孢杆菌属种类(例如枯草芽孢杆菌)，子囊菌纲的棉阿舒囊霉和阿舒假囊酵母，各种酵母菌株如季也蒙假丝酵母和Candida famata和相关菌株及其它微生物通过发酵方法合成。酵母中核黄素生物合成途径如附图说明图1所示。维生素生物合成的前体是鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP)和核酮糖5-磷酸。合成1摩尔核黄素需要1摩尔GTP和2摩尔核酮糖5-磷酸。在酵母如酿酒酵母中，维生素生物合成至少需要6个基因，具体地RIB1,RIB2,RIB3,RIB4,RIB5和RIB7。已证明在季也蒙假丝酵母中核黄素的生物合成也需要6个基因的产物，具体是基因RIB1,RIB2,RIB3,RIB4,RIB5和RIB6(2)。这些季也蒙假丝酵母基因的特定酶和它们在生物合成中的作用已总结于图1中。与枯草芽孢杆菌中情况相反，真核生物酿酒酵母和季也蒙假丝酵母中核黄素生物合成基因不成簇存在。生物合成的初始步骤是由GTP环化水解酶Ⅱ催化的GTP咪唑环的打开。已有报道此酶的产物是2,5-二氨基-6-核糖氨基-4(3H)-嘧啶酮5’-磷酸。此中间产物通过一系列支链还原作用、环脱氨基作用和去磷酸化作用转化成5-氨基-6-核糖醇氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮。参与5-氨基-6-核糖醇氨基5’磷酸的去磷酸化作用的假想酶仍不清楚。5-氨基-6-核糖醇氨基-2,4(1H,3H)嘧啶二酮在6,7-二甲基-8-核糖醇基2,4-二氧四氢蝶啶合成酶的作用下转化为6,7-二甲基-8-核糖醇基2,4-二氧四氢蝶啶的反应需要第二种底物3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸，该底物是通过3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合成酶的催化作用从核酮糖5-磷酸得来的。最后，6,7-二甲基-8-核糖醇基2,4-二氧四氢蝶啶在核黄素合成酶的催化作用下经过歧化作用转变成核黄素。指导核黄素合成途径的初始酶，GTP环化水解酶Ⅱ合成的RIB1基因序列已在酵母季也蒙假丝酵母中得到确定(4)。例如在EP 405 370中已有描述用于发酵生产核黄素的枯草芽孢杆菌重组菌株。这些菌株带有在指导同类酶大量合成的强启动子的控制下的核黄素操纵子。在强启动子控制下的核黄素操纵子的基因构建体可以存在于枯草芽孢杆菌染色体的一个或几个不同位置上。已证明，在强启动子控制下的核黄素途径的其它基因在枯草芽孢杆菌染色体其它位置的插入可以增加通过发酵得到的核黄素产量，见EP 821 063。尽管已有报道用酵母菌株如季也蒙假丝酵母生产核黄素，但到目前为止，DNA重组技术还未用于季也蒙假丝酵母或相关产黄素酵母中核黄素生物合成基因的过量表达。因此，本专利技术的目的是提供能制备过量合成核黄素的酵母菌株的重组方法。更具体地，本专利技术的目的是提供一种酵母菌株，此酵母菌株已用包含编码至少一种具核黄素生物合成活性的多肽并在适当寄主中表达的DNA序列的重组DNA序列转化，所述DNA序列在这种酵母菌株中与有功能的启动子可转录地相连；甚至更具体地这种酵母菌株属于在铁离子缺失条件下能过量合成核黄素的产黄素酵母类，诸如选自以下类许旺酵母属，优选地许旺酵母，德巴利酵母属，优选地克洛德巴利酵母，球拟酵母属，优选地白球拟酵母，或特别地假丝酵母属，优选地季也蒙假丝酵母或C.famata的酵母菌株〔Logvinenko等，Ukrainskii Biokhimicheskii Zhurnal 61(1),28-32,1989；Logvinenko等，Mikrobiologiya 57(2),181-186,1988以及Nakase和Suzuki，普通和应用微生物学报31(1):49-70(1985)〕。本专利技术的另一目的是提供其中编码多肽的DNA序列来自酵母，优选地来自在铁离子缺失条件下能过量合成核黄素的产黄素酵母，更优选地来自假丝酵母属如季也蒙假丝酵母或C.famata的酵母菌株。本专利技术的目的也包括提供其中编码多肽的DNA序列编码具有GTP环化水解酶Ⅱ活性的蛋白并选自以下DNA序列的酵母菌株a)图5所示的DNA序列或其互补链，b)在标准条件下与a)中所定义的DNA序列的蛋白编码区域或其片段杂交的DNA序列。c)除了遗传密码的兼并性，与a)和b)中定义的DNA杂交的DNA序列。本专利技术另一目的是提供其中启动子是酿酒酵母TEF启动子的酵母菌株。本专利技术另一目的是提供核黄素的生产方法，其特征在于在适当培养条件培养上述酵母菌株以及用本领域技术人员所知的方法从培养基或酵母菌株分离合成的核黄素；以及食品或饲料组合物的生产方法，其特征在于用本领域技术人员所知的方法将用这样的方法获得的核黄素与一种或多种适当的食品或饲料成分混合。在本专利技术的实施中使用的所有季也蒙假丝酵母菌株都是来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的登记号为ATCC 9058的季也蒙假丝酵母的衍生种(1)。季也蒙假丝酵母(ATCC 9058)已根据布达佩斯条约于1998年4月1日重新保藏并得到登记号ATCC 74437。季也蒙假丝酵母是在铁离子缺失情况下可以过量合成核黄素(维生素B2)的酵母种类的代表性菌株。这一类还包括许旺酵母(也称为Debaryomycesoccidentalis)、克洛德巴利酵母、白球拟酵母和C.famata。后者已用于核黄素的工业生产。关于酵母种类分类命名，本领域技术人员知道这些命名由不同的作者不定地掌握，例如Candida famata-汉逊德巴利酵母-Torulaspora hansenii，季也蒙假丝酵母-季也蒙毕赤酵母-Yamadazyma guilliermondii作为同物异名使用。本领域技术人员知道可以用于本专利技术的实施作为寄主细胞或作为分离DNA序列来源的微生物可从保藏单位如美国典型培养物保藏中心(ATCC)，真菌菌种保藏中心(CBS)或德意志微生物保藏中心(DSM)和其它列于“工业产权”杂志中任何保藏单位得到。用于本专利技术实施并编码具有核黄素生物合成活性的多肽的DNA序列可以例如用本领域技术人员所掌握的方法或使用著名的PCR技术以基因组或cDNA序列的形式从任何已知合成核黄素的微生物(见上)中获得。White等已描述了多聚酶链式反应(PCR)方法的原理，而改进方法也得到描述，例如参见Innis等。设计PCR引物所需的序列信息可以从例如诸如基因库(Intelligenetics，加利福尼亚，美国)，欧洲生物信息研究所(HinstonHall，剑桥，英国)，NBRF(Georgetown大学医学中心，华盛顿，美国)和Vecbase(威士康星大学生物技术中心，Madison，威士康星，美国)的序列数据库得到。一旦得到这样的DNA序列，它们就可以在任何目的寄主中表达，并且编码多肽的核黄素生物合成活性可以通过本领域技术人员所知的任何测定法测定，这些方法例如描述于Bacher A.,G.Richter,H.Ritz,S.Eberhardt,M.Fisher和Krieger，核黄素的生物合成GTP环化水解酶Ⅱ、脱氨酶和还原酶，酶学方法，19本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酵母菌株，此酵母菌株已用包含编码至少一种具核黄素生物合成活性的多肽并在适当寄主中表达的ＤＮＡ序列的重组ＤＮＡ序列转化，所述ＤＮＡ序列在这种酵母菌株中与有功能的启动子可转录地相连。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：LY巴布亚克，A巴彻尔，YR波利特斯基，VV戴姆奇辛，S艾伯哈德特，D法德罗维赫，H露特根，G莱西特，A范鲁恩，
申请(专利权)人：DSMIP资产有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]