一种由三尖杉细胞组织培养生产寡聚糖诱抗剂的方法技术

一种由三尖杉细胞组织培养生产天然寡聚糖诱抗剂的方法，所生产的诱抗剂主要含有寡聚糖、多糖、单糖、部分色素和盐类物质，该方法包括三尖杉细胞组织建立、培养及寡聚糖提取步骤，其特征在于：（１）采用的三尖杉细胞组织是由三尖杉植株叶片诱导的愈伤组织；（２）三尖杉细胞的培养条件；（ａ）固体培养：６－７Ｖ固体培养基，接种量１～３ｇ／１００ｍｌ，温度２５～３０℃，湿度６５～８０％，光强１０００～３０００ｌｘ；（ｂ）液体培养：６－７Ｖ液体培养基，接种量１～３ｇ／１００ｍｌ，温度２５～３０℃，转速５０～１００ｒｐｍ，光强１０００～３０００ｌｘ。本发明专利技术可以实现大规模工业化生产，不受植物生产季节和环境变化的影响。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供了一种由三尖杉(Cephalotaxus fortunei Hook，f)细胞培养所产生的诱导植物抗病性的物质--寡聚糖诱抗剂。利用植物细胞培育的方法，可以得到较高产率的三尖杉细胞，进而提取诱导植物抗病性的寡聚糖诱抗剂。三尖杉(Cephalotaxus fortunei Hook，f)是我国特有的一种含有抗癌生物碱活性和具有较高诱导植物抗病活性的树种。植物对于病害的抗性是固有的，而对病害的敏感性则是在外界诱导下所产生的。这种能诱导植物防卫反应的一些生物来源和非生物来源的物质称为激发子。低聚糖便是这众多激发子中的一种。从三尖杉细胞壁中所得到的低聚糖片断，具有生物调控活性，它能激发植物产生一系列新的抗菌物质(植保素、酚类、木质素、胼胝质等)，防御病原菌和其它形式的侵害，达到防止植物病害发生的作用。本专利技术的目的在于提供一种由三尖杉细胞组织培养生产寡糖诱抗剂的方法，其可以实现大规模工业化生产，不受植物生产季节和环境变化的影响。本专利技术提供了一种由三尖杉细胞组织培养生产天然寡聚糖诱抗剂的方法，所生产的诱抗剂主要含有寡聚糖、多糖、单糖、部分色素和盐类物质，该方法包括三尖杉细胞组织建立、培养及寡聚糖提取步骤，其特征在于(1)采用的三尖杉细胞组织是由三尖杉植株叶片诱导的愈伤组织；(2)三尖杉细胞的培养条件；(a)固体培养6-7V固体培养基，接种量1～3g/100ml，温度25～30℃，湿度65～80％，光强1000～3000lx；(b)液体培养6-7V液体培养基，接种量1～3g/100ml，温度25～30℃，转速50～100rpm，光强1000～3000lx。本专利技术中三尖杉愈伤组织的诱导过程是将三尖杉植株叶片清洗、消毒、切片、平铺在MS培养基上，在温度为25～30℃，湿度为65～80％，光强为1000～3000lx条件下培养20～40天，其边缘切口部分隆起，长出一团团淡黄色细胞团即为三尖杉愈伤组织。本专利技术三尖杉细胞中寡聚糖的提取可以采用酶提法，即将三尖杉细胞清洗、过滤、搅碎、离心，沉淀物用纤维素酶搅拌酶解，温度35～40℃，时间1～3小时，沸水终止酶反应，用水1∶50～100浸提2～5小时后高心，浓缩即为寡聚糖粗提液。本专利技术三尖杉细胞中寡聚糖的提取还可以采用热提法，即三尖杉细胞清洗、过滤、搅碎、离心，加1∶50～100水，将细胞悬浮于水中，在0.5～2个大气压100～150℃下加热1～5小时，热提100～150℃，1～5小时，离心，浓缩即为寡聚糖粗提液。本专利技术使用植物组织培养新的分析技术和实验手段，可以代替植株、器官培养，使植物细胞的生产不受植物生长季节和环境变化的影响，而且实验周期短，有利于重复试验，更重要的是三尖杉寡聚糖诱抗剂的性能，不仅能够诱导植物产生抗病作用，而且作为一种无公害、无污染、无毒副作用、用量少、药效高的新型绿色农药；它的工业化生产必将为我国农业生产带来巨大的经济效益。下面通过实施例详述本专利技术。实施例11.三尖杉细胞的诱导1)从三尖杉植株上取叶片用清水洗净(以下步骤均在无菌室超净工作台上进行)；2)洗净的叶片用8％NaClO3消毒10min后用无菌水冲洗5次，将水用无菌纸吸于；3)将叶片切成约1cm的小方块，平铺在MS培养基上，在温度为27℃，湿度为75％左右，光强为2500lx的光照培养箱中培养；4)培养一个月左右的叶片，其边缘切口部分隆起，长出一团团淡黄色的细胞团，即为三尖杉愈伤组织。2.三尖杉固体细胞及悬浮细胞培养的建立1)将以上生长旺盛的淡黄色细胞团取下，转入新配制好的6-7V固体培养基中，接种量1g/100ml在温度为27℃，湿度为75％左右，光强为为2500lx的光照培养箱中继续培养；·经多次重复继代，即可获得性状比较一致的细胞株系，即为细胞固体培养；2)将继代5次的固体培养细胞，压碎转接到6-7培养基中，接种量2g/100ml，在温度为27℃，转速为100rpm的摇床上培养·培养一个月左右后，将所培养的三尖杉细胞上清培养液滤去，加入新的液体培养基，继续培养即为三尖杉悬浮培养。所用的培养基成份如下MS培养基 6-7V培养基大量元素NH4NO31650(mg/L)(NH4)2SO41250KNO21900 1000CaCl2·2H2O440 188MgSO·7H2O 370 125KCl 250NaH2PO4·2H2O 209Na2HPO4·12H2O643KH2PO4170微量元素KI 0.830.125H3BO36.312.5MnSO4H2O 22.3 11.25ZnSO4·7H2O8.63.75Na2MoO4·2H2O0.25 0.625CuSO4·5H2O 0.025 0.625CoCl2·6H2O 0.025 0.625Na2EDTA37.347.5FeSO4·7H2O 27.8 34.75肌醇100.0100於酸 0.6烟酸 0.5盐酸吡哆醇 0.5 0.5盐酸硫胺素 0.1 0.5甘氨酸 2.0吲哚乙酸 1-30萘乙酸 1-30激动素 0.04-10 0.04-10蔗糖 30.0％30.3％蛋白冻 10g/L琼脂0.8 0.8％pH 5.8 6.03.三尖杉细胞中寡聚糖的提取及制备1)酶提法·三尖杉细胞用蒸馏水冲洗三次，然后过滤·用细胞组织搅碎机将细胞搅碎，然后离心；·沉淀物用纤维素酶搅拌酶解(35～40℃，1～3h)；·沸水10min终止酶反应；·用水(1∶50～100)再浸提2～5小时后离心；·浓缩(原体积的1～10％)后即为寡聚糖粗提液。2)热提法·三尖杉细胞用蒸馏水冲洗数次，过滤；·用细胞捣碎机细胞搅碎，然后离心；·加水，将细胞悬浮在水中(1∶50～100)；·在高压100～150℃下加热1～5小时；·然后再热提(50～100℃，1～5h)；·离心，浓缩(原体积的1～10％)后即为寡聚糖粗提液。4.三尖杉寡聚糖诱抗剂诱导植物抗病的作用方法是1)寡聚糖诱抗剂的浓度为1～5％；2)其使用范围稀释100～500倍；3)浸种稀释200～400倍；4)拌种稀释200～500倍；5)叶面喷施稀释100～300倍。实施例2不同激素组合对三尖杉悬浮细胞生产及寡聚糖产生的影响 实施例3不同转速对三尖杉悬浮细胞生产及寡聚糖产生的影响 实施例4苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响试验 苯丙氨酸解氨酶是直接控制植保素合成中的第一步反应，故它的活性愈高，说明产生的植保素愈多，植物的抗性就较强。寡聚糖对代谢有明显激活作用。权利要求1.一种由三尖杉细胞组织培养生产天然寡聚糖诱抗剂的方法，所生产的诱抗剂主要含有寡聚糖、多糖、单糖、部分色素和盐类物质，该方法包括三尖杉细胞组织建立、培养及寡聚糖提取步骤，其特征在于(1)采用的三尖杉细胞组织是由三尖杉植株叶片诱导的愈伤组织；(2)三尖杉细胞的培养条件；(a)固体培养6-7V固体培养基，接种量1～3g/100ml，温度25～30℃，湿度65～80％，光强1000～3000lx；(b)液体培养6-7V液体培养基，接种量1～3g/100ml，温度25～30℃，转速50～100rpm，光强1000～3000lx。2.按照权利要求1所述由三尖杉细胞组织培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由三尖杉细胞组织培养生产天然寡聚糖诱抗剂的方法，所生产的诱抗剂主要含有寡聚糖、多糖、单糖、部分色素和盐类物质，该方法包括三尖杉细胞组织建立、培养及寡聚糖提取步骤，其特征在于：（１）采用的三尖杉细胞组织是由三尖杉植株叶片诱导的愈伤组织 ；（２）三尖杉细胞的培养条件；（ａ）固体培养６－７Ｖ固体培养基，接种量１～３ｇ／１００ｍｌ，温度２５～３０℃，湿度６５～８０％，光强１０００～３０００ｌｘ；（ｂ）液体培养６－７Ｖ液体培养基，接种量１～３ｇ／１００ｍｌ，温 度２５～３０℃，转速５０～１００ｒｐｍ，光强１０００～３０００ｌｘ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：白雪芳，杜昱光，王靖楣，王毓福，朱亮，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]