一种通过使用腈水解酶或含有腈水解酶的微生物来从腈类物质中制备手性羧酸的方法技术

本发明专利技术涉及到编码具腈水解酶活性的多肽的核酸序列，含有该核酸序列的核酸构建物以及含有该核酸序列或该核酸构建物的载体。本发明专利技术进一步涉及到被该核酸序列所编码的氨基酸序列，以及含有该核酸序列、该核酸构建物或含有该核酸序列或该核酸构建物的载体的微生物。本发明专利技术还涉及到从外消旋的腈类物质中制备手性羧酸的方法。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及到编码具腈水解酶活性的多肽的核酸序列，含有该核酸序列的核酸构建物以及含有该核酸序列或该核酸构建物的载体。本专利技术进一步涉及到被该核酸序列所编码的氨基酸序列，以及含有该核酸序列、该核酸构建物或含有该核酸序列或该核酸构建物的载体的微生物。本专利技术还涉及到从外消旋的腈类物质中制备手性羧酸的方法。手性羧酸是有机化学合成所需的化合物。它们是一大批药学活性成分或用于农作物保护的活性组分的起始材料。手性羧酸可被用于通过非对映体盐类来进行的经典的外消选体拆分。这样，R-(-)-或S-(-)-苯基乙醇酸被用于，例如，外消旋胺的外消旋拆分。R-(-)-苯基乙醇酸还被用作半合成抗生素和大量的农用产品的合成的中间体。在文献中披露了手性羧酸的多种不同的合成路线。这样，例如，通过发酵方法可工业化地获得旋光活性的氨基酸。这些方法导致以下缺点，即对每一种氨基酸都需要开发一种特别的加工方法。这就是为什么要使用化学或酶学方法以制备最大范围的不同的化合物。化学方法的一个缺点是经常必须在一个复杂的，多阶段的，应用不广泛的合成中构建立体中心。手性羧酸的酶学合成可见于许多专利或专利中请中。WO92/05275描述α-羟基-α-烷基或α-烷基羧酸的对映构建物在生物物质存在下的合成。EP-B-0 348 901要求一种方法的权利，该方法用于通过使用产碱杆菌属，假单胞菌，红假单胞菌属，棒状杆菌菌株KO-2-4，不动杆菌，芽孢杆菌，分支杆菌，红球菌属和假丝酵菌的微生物来制备旋光活性的α-取代有机酸。使用微生物对L-α-氨基酸的制备的权利要求见EP-B-0 332 379。α-羟基羧酸的制备，具体来说是使用各种微生物，例如金杆菌属，假单胞菌，红假单胞菌属，棒状杆菌，不动杆菌，乳酪杆菌，芽孢杆菌，分支杆菌，红球菌属，短杆菌属，土壤丝菌属，贪噬菌属，节核细菌属和假丝酵菌的微生物，或使用酶来进行的对乳酸或苯基乙醇酸的制备，其描述见于专利EP-A-0 348 901或其对应的US5,283,193，EP-A-0 449 648，EP-B-0 473 328，EP-B-0 527 553或其对应的US 5,296,373，EP-A-0 610 048，EP-A-0 610 049 EP-A-0666 320或WO97/32030。这些方法的缺点为它们通常产生具较低的旋光纯度的产物和/或进行这些方法时空间-时间产量较低。这导致这些方法不具经济吸引力。甚至通过添加诸如亚硫酸盐，二亚硫酸盐，连二亚硫酸盐，次亚磷盐或亚磷酸盐这样的物质(见EP-A-0 486 289)或通过使用具备提高的针对α-羟基腈的抗性的微生物(见WO97/32030)来提高生产能力的尝试也导致生产能力增长可忽略。本专利技术的一个目标是开发一种简单，有成本效益的，应用广泛的方法以制备旋光活性的手性羧酸，该方法没有上述的缺点。我们已经发现，这一目标已经通过一个方法实现，该方法根据于本专利技术，本专利技术用于在存在一种氨基酸序列或微生物的情况下制备通式I的手性羧酸 该制备包括转化外消旋腈，其具有通式II 该氨基酸序列由选自以下群体的核酸序列编码a)一个核酸序列，它具有在SEQ ID NO1中所描述的序列，b)一些核酸序列，它们衍生于在SEQ ID NO1中所描述的序列，是遗传密码简并的结果，c)在SEQ ID NO1中所描述的序列的变体，它们编码一些多肽，这些多肽具有SEQ ID NO2中所描述的序列并且在氨基酸水平上具有至少80％的同源性，该多肽的酶活性上无实质性的降低，或者该微生物为一种生长中的，休眠的或被破碎的微生物体，它含有来自上述的群体的一种核酸序列或一种核酸构建物，该构建物将来自所述的群体的核酸序列同一种或更多种调控信号相连接，该体系中至少每小时每毫克蛋白或每克干重将25mmol腈转化为手性羧酸，其中，结构式I和II中的取代基和变量具有以下意义*一个旋光活性中心R1，R2，R3各自独立地为氢，取代或未取代的及分支或无分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，取代或未取代的芳基，杂芳基，OR4或NR4R5，其中基团R1，R2，R3总是各不相同，R4氢，取代或未取代的及分支或无分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，C1～C10-烷羰基，C2～C10-烯基羰基，芳基，芳基羰基，杂芳基或杂芳基羰基，R5氢，取代或未取代的及分支或无分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，芳基或杂芳基。结构式I和II的化合物的R1，R2，R3各自独立地为氢，取代或未取代的及分支或无分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，取代或未取代的芳基，杂芳基，OR4或NR4R5，其中基团R1，R2，R3总是各不相同。可能提及的烷基基团为取代或未取代的，分支或无分支的C1～C10-烷基链，例如，甲基，乙基，n-丙基，1-甲基乙基，n-丁基，1-甲基丙基，2-甲基丙基，1，1-二甲基乙基，n-戊基，1-甲基丁基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，2，2-二甲基丙基，1-乙基丙基，n-己基，1，1-二甲基丙基，1，2-二甲基丙基，1-甲基戊基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，4-甲基戊基，1，1-二甲基丁基，1，2-二甲基丁基，1，3-二甲基丁基，2，2-二甲基丁基，2，3-二甲基丁基，3，3-二甲基丁基，1-乙基丁基，2-乙基丁基，1，1，2-三甲基丙基，1，2，2-三甲基丙基，1-乙基-1-甲基丙基，1-乙基-2-甲基丙基，n-庚基，n-辛基，n-壬基，n-癸基。甲基，乙基，n-丙基，n-丁基，i-丙基或i-丁基较为优选。可能提及的烯基基团为取代或未取代的C2～C10-烯基链，例如，乙烯基，丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯基，3-丁烯基，2-甲基丙烯基，1-戊烯基，2-戊烯基，3-戊烯基，4-戊烯基，1-甲基-1丁烯基，2-甲基-1-丁烯基，3-甲基-1丁烯基，1-甲基-2丁烯基，2-甲基-2丁烯基，3-甲基-2丁烯基，1-甲基-3丁烯基，2-甲基-3丁烯基，3-甲基-3丁烯基，1，1-二甲基-2-丙烯基，1，2-二甲基-1-丙烯基，1，2-二甲基-2-丙烯基，1-乙基-1-丙烯基，1-乙基-2-丙烯基，1-己烯基，2-己烯基，3-己烯基，4-己烯基，5-己烯基，1-甲基-1-戊烯基，2-甲基-1-戊烯基，3-甲基-1-戊烯基，4-甲基-1-戊烯基，1-甲基-2-戊烯基，2-甲基-2-戊烯基，3-甲基-2-戊烯基，4-甲基-2-戊烯基，1-甲基-3-戊烯基，2-甲基-3-戊烯基，3-甲基-3-戊烯基，4-甲基-3-戊烯基，1-甲基-4-戊烯基，2-甲基-4-戊烯基，3-甲基-4-戊烯基，4-甲基-4-戊烯基，1，1-二甲基-2-丁烯基，1，1-二甲基-3-丁烯基，1，2-二甲基-1-丁烯基，1，2-二甲基-2-丁烯基，1，2-二甲基-3-丁烯基，1，3-二甲基-1-丁烯基，1，3-二甲基-2-丁烯基，1，3-二甲基-3-丁烯基，2，2-二甲基-3-丁烯基，2，3-二甲基-1-丁烯基，2，3-二甲基-2-丁烯基，2，3-二甲基-3-丁烯基，3，3-二甲基-1-丁烯基，3，3-二甲基-2-丁烯基，1-乙基-1-丁烯基，1-乙基-2-丁烯基，1-乙基-3-丁烯基，2-乙基-1-丁烯基，1-乙基-2-丁烯基，2-乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种被分离的核酸序列，该序列编码一种具有腈水解酶活性的多肽，该核酸序列选自以下群体：ａ）一个核酸序列，该序列具有在ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中所描述的序列，ｂ）一些核酸序列，它们衍生自ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所描述的序列，使遗传密码简并性 的结果，ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所描述的核酸序列的衍生体，这些衍生体编码的多肽具有在ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２中所描述的氨基酸序列并且在氨基酸水平上具有至少９５％的同源性，这些多肽在酶活性上没有实质性降低。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M雷斯莱施克，T弗里德里希，B豪尔，R马特斯，D恩格尔斯，
申请(专利权)人：BASF公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]