位点专一性同位素标记的蛋白质、氨基酸，及其生物化学前体制造技术

本发明专利技术提供位点专一性同位素标记的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，以及这些氨基酸的生物合成前体。用［１３］↑Ｃ或［１４］↑Ｃ在这些氨基酸中离羧基最远的甲基碳原子上进行标记。本发明专利技术还公开了这些标记的氨基酸的生物化学前体，２－酮－４－（［ｎ］↑Ｃ）－丁酸和２－酮－３－（［ｎ］↑Ｃ－甲基）－４－（［ｎ］↑Ｃ）－丁酸，其中的ｎ在各种情况下分别为１３或１４。还公开了含有这些位点专一性同位素标记的氨基酸的蛋白、蛋白片段、和多肽，以及制备所述生物化学前体、氨基酸，以及蛋白、蛋白片段和多肽的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术介绍位点专一性同位素标记的有机化合物及其制备方法。更具体而言，本专利技术涉及位点专一性同位素标记的亮氨酸、异亮氨酸，和缬氨酸的生物化学前体、所述同位素标记的氨基酸本身，及由其制成的蛋白质、蛋白片段或多肽，以及有关的制备方法。
技术介绍
近来发展起来的探索新药物的技术，将核磁共振(NMR)谱学用来发现与特别的靶分子结合的化合物，这种靶分子例如为蛋白质(参见例如Fesik等的美国专利No.5,698,401和5,804,390)。该技术包括测定蛋白的第一个二维15N/1H NMR相关光谱，该蛋白的氮原子位点富含同位素15N。此蛋白的第一相关光谱是在没有任何可能是配体化合物的情况下测得的。然后，将有可能是配体的化合物，或此类假定为配体化合物的混合物与富含同位素氮的蛋白混合，得到第二个NMR相关光谱。比较这两种光谱，由该两种光谱间的差别可得到以下有关资料1)任何配体与主体蛋白间的结合是否存在，2)该结合的位点(一个或多个)，以及3)该结合的强度。上述Fesik等描述的技术中，采用了靶分子，该靶分子富含NMR可检测的同位素15N自旋原子核。这种方法依赖于将适合的微生物进行遗传修饰，以表达所需要的蛋白质、蛋白片段，或多肽，然后将此修饰后的微生物在含有可同化的碳源和氮源的营养培养基上培养，该氮源包括15N标记的营养物。较便宜的市售15N铵盐可提供此15N源。但是，这种NMR药物探索技术，在用于富含同位素13C的靶分子时，却受到二个缺点的限制。第一，要生产出有效量的富含13C的靶分子是比较昂贵的。例如，用遗传修饰的微生物，在含有市售均匀标记的葡萄糖(葡萄糖-13C6)营养培养基上生长，来生产蛋白质成本很高。在递交本申请时，葡萄糖-13C6的价格大约为$480/g。另一种生产13C-标记的蛋白质的方法，是营养培养基中包含13C-均匀标记的氨基酸，同样也是昂贵的。第二，用葡萄糖-13C6或市售的均匀富含13C的氨基酸所生产的生物分子，用于NMR相关光谱技术并不理想。微生物在含有均匀富含13C原料的营养培养基上生长时，它所表达的生物分子含有与其邻近的13C-标记碳原子。因为NMR技术是建立在探测空间自旋偶合(亦即核极化效应)的基础上的，邻近的13C原子核的较强自旋-自旋偶合干扰了所要观察的结果。因此，需要开发位点专一性的富含13C的氨基酸、蛋白质和多肽。专利技术概述本专利技术提供位点专一性富含同位素的氨基酸，即亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸的生物化学前体，以及位点专一性富含同位素的氨基酸本身。此外，还提供含有位点专一性富含同位素的氨酰基残基的蛋白质、蛋白片段和多肽，以及它们的生产方法，该氨酰基残基来源于上述位点专一富含同位素的氨基酸。该氨基酸及其生物合成前体中，在离其羧基最远的甲基碳原子上，富含同位素13C或14C。在本专利技术的标记氨基酸中，不存在相邻碳原子被标记的情况。在标记物为13C的情况下，本专利技术的氨基酸能理想地用于NMR药物探测技术，因为不出现相邻碳原子的13C-13C自旋-自旋相互作用而干扰所需要的信号。而且，因为仅在该氨基酸的甲基碳原子上标记，该甲基上，三个磁性相同的氢原子提供很强NMR信号，用以观察这些氧原子与其相连的13C原子间任何偶合效应。具体而言，本专利技术提供分子式为I的化合物或其盐， 其中R1为氧或NH2，R2选自下列基团 在以上所示的分子式中，R3为氢或nCH3，虚线键代表价键，m为0或1，而n在各种情况下分别为13或14，但要满足以下条件a)R1为NH2时，连接R1的虚线所代表的第二价键不存在，而与虚线连接的氢存在；b)R1为氧时，与R1连接的虚线所代表的第二价键存在，而与虚线键连接的氢原子不存在；c)R1为氧时，R2为B式，m为0；以及d)R1为NH2时，R3为氢或nCH3。本专利技术提供位点专一性富含13C和14C的氨基酸，异亮氨酸(上述的分子式I，其中R1为氨基，R2为A)；亮氨酸(上述的分子式I，其中R1为氨基，R2为B，R3为nCH3，以及m为1)，以及缬氨酸(上述的分子式I，其中R1为氨基，R2为B，R3为nCH3，以及m为0)，以及位点专一性富含13C和14C的这些氨基酸的生物化学前体，2-酮-4-(nC)-丁酸(上述的分子式I，其中R1为氧，R2为B，m为0，以及R3为氢)，和2-酮-3-(nC-甲基)-4-(nC)-丁酸(上述的分子式I，其中R1为氧，R2为B，m为0，以及R3为nCH3)。上述的n代表13(亦即富含13C的化合物)或14(亦即富含14C的化合物)。本专利技术还提供含有氨酰基残基的蛋白质、蛋白片段，和多肽，该氨酰基残基来源于选自以下的一种或多种氨基酸L-2-氨基-3-甲基-5-(13C)-戊酸；L-2-氨基-3-甲基-5-(14C)-戊酸；L-2-氨基-4-(13C-甲基)-5-(13C)-戊酸；L-2-氨基-4-(14C-甲基)-5-(14C)-戊酸；L-2-氨基-3-(13C-甲基)-5-(13C)-丁酸；以及L-2-氨基-3-(14C-甲基)-5-(14C)-丁酸。本专利技术还提供位点专一性13C和14C标记的生物化学前体酸，即2-酮-4-(nC)-丁酸和3-(nC-甲基)-4-(nC)丁酸，或其盐类的化学制备方法，该方法包括将分子式为IV的化合物与同位素标记的碘代甲烷(H3nCI)反应， 产生分子式为V的化合物 除去分子式V化合物中叔丁基酯保护基和二甲基肼基保护基，生成2-酮-4-(nC)-丁酸；或进-步将分子式为V的化合物与同位素标记的碘代甲烷(H3nCI)反应，其中n为13或14，生成分子式为VI的化合物 除去叔丁基酯保护基二甲基肼基保护基，生成2-酮-3-(nC-甲基)-4-(nC)-丁酸；并视需要可将此产物成盐。本专利技术另外还提供位点专一性13C和14C标记的氨基酸，即亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的制备方法。该方法包括将微生物进行遗传修饰，使其能表达含某种氨基酸的多肽，该氨基酸选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸，以及它们的混合物；将修饰后的微生物在含有可同化的碳源和氮源的营养培养基上培养，所述碳源和氮源包括2-酮-4(nC)-丁酸、2-酮-3-(nC-甲基)-4-(nC)-丁酸，以及它们的盐类和混合物；分离所产生的表达多肽；将此多肽裂解，并分离出个体氨基酸。可用本领域所知的常用方法裂解表达的多肽，这些方法包括水解或酶促裂解。通过将宿主微生物修饰，使其表达氨基酸的均聚物，并在营养培养基中采用适合的富含同位素的生物合成前体，可将特定的氨基酸产量提高到最高，而使其成本降到最低。本专利技术还进一步提供含氨酰基的蛋白质、蛋白片段，或多肽的制备方法，该氨酰基所来自的氨基酸选自L-2-氨基-3-甲基-5-(13C)-戊酸；L-2-氨基-3-甲基-5-(14C)-戊酸；L-2-氨基-4-(13C-甲基)-5-(13C)-戊酸；L-2-氨基-4-(14C-甲基)-5-(14C)-戊酸；L-2-氨基-3-(13C-甲基)-5-(13C)-丁酸；以及L-2-氨基-3-(14C-甲基)-5-(14C)丁酸，该制备方法包括将微生物进行遗传修饰，使其表达预定的蛋白质、蛋白片段或多肽；在含有可同化的碳源和氮源的营养培养基上培养该修饰后的微生物，所述碳源和氮源包括2-酮-4-(nC)-丁酸、2-酮-3本文档来自技高网...

【技术保护点】
式Ⅰ化合物或其盐， ＊＊＊ Ⅰ 其中 Ｒ↑［１］为氧或ＮＨ↓［２］； Ｒ↑［２］选自下述基团： ＊＊＊和＊＊＊， 其中Ｒ↑［３］为氢或［ｎ］↑ＣＨ↓［３］； 虚线键代表第二价键； ｍ为０或１； 而ｎ在各种情况下分别为１３或１４；所述分子式要满足以下条件： （ｉ）当Ｒ↑［１］为ＮＨ↓［２］时，连接Ｒ↑［１］的虚线所代表的第二价键不存在，而与虚线键连接的氢存在； （ｉｉ）当Ｒ↑［１］为氧时，与Ｒ↑［１］连接的虚线所代表的第二价键存在，而与虚线键连接的氢原子不存在； （ｉｉｉ）当Ｒ↑［１］为氧时，Ｒ↑［２］为Ｂ式，ｍ为０；以及 （ｉｖ）当Ｒ↑［１］为ＮＨ↓［２］时，Ｒ↑［３］为氢或［ｎ］↑ＣＨ↓［３］。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：SW菲斯克，DJ奥格里，
申请(专利权)人：艾博特公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]