经修饰的细胞色素P450单加氧酶制造技术

本发明专利技术涉及到一些经修饰的细胞色素Ｐ４５０单加氧酶，这些单加氧酶具有改变的底物分布，本发明专利技术还涉及到编码该酶的核酸序列、表达结构体和载体、含有这些载体的重组微生物体以及用于进行末端或者次末端羟化的脂肪族羧酸的微生物生产的加工过程。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及到一些经修饰的细胞色素P450单加氧酶，这些单加氧酶具有改变的底物分布，本专利技术还涉及到编码该酶的核酸序列、表达结构体和载体、含有这些载体的重组微生物体以及用于进行末端或者次末端(subterminally)羟化的脂肪族羧酸的生物生产的加工过程。名为P450BM-3的单加氧酶为来自巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)的一种细胞色素P450酶，并且该酶同哺乳类P450酶具有显著的序列同源性(1)。由于这些相关性，P450 BM-3便构成了该类P450酶的一个优秀的模式系统。P450 BM-3主要在长链饱和脂肪酸的ω-1、ω-2和ω-3碳原子上进行羟化。酰胺或醇类似物以及不饱和脂肪酸的环氧化物也可被转化(1-3)。对饱和脂肪酸的催化活性取决于其链长，最佳链长为14至16个碳原子。该酶对链长短于12个碳原子的脂肪酸不表现出催化活性(1)。专利技术概述本专利技术的一个目的是提供一些细胞色素P450单加氧酶突变体，该突变体同野生型酶相比表现出经修饰的底物分布。特别地，一个目的为提供一种新的突变体，该突变体在另一个链位置羟化饱和的脂肪羧酸并且/或者具有一种经修饰的底物特异性。特别地，一个目的为提供一种对中等链长的脂肪族羧酸具有催化活性的突变体，特别是对链长为8到12个碳原子的脂肪族羧酸，如，8到10个碳原子，并且该突变体在次末端对该羧酸进行羟化，特别是在位置ω-1、ω-2和/或ω-3。我们发现，该目的已经通过提供经修饰的细胞色素P450单加氧酶而实现，由于其底物结合区域上的直接进化以及位点特异性突变的综合作用，该酶在对脂肪族羧酸进行的末端和/或次末端酶促羟化上同野生型相比较表现出变化的反应模式或底物分布。专利技术详述同野生型的酶相比较，本专利技术的突变体中观察到了“变化的底物分布”。根据本专利技术的目的，“变化的底物分布”指的是，a)一种改善的反应性，例如，比活的提高(以nmol反应羧酸/分钟/nmol P450酶表示)或者至少一种动力学参数的提高，该参数选自Kcat、Km和Kcat/Km，例如该突变体对于至少一种可羟化的脂肪族羧酸或者一种脂肪族羧酸的一种可羟化的衍生物具有至少1％的提高，例如，10到1000％、10到500％或10到100％的提高，以及/或者b)在该羧酸的羟化中的一种改变的区域选择性，特别是一种提高的区域选择性。由此产生了在至少一种可羟化的脂肪族羧酸或者一种脂肪族羧酸的一种可羟化的衍生物中的优选的末端或次末端(ω-1、ω-2、ω-3、ω-4，特别是ω-1到ω-3)羟化位置的变动。可观察到与本专利技术一致的“变化的底物分布”的可羟化脂肪族羧酸或其衍生物为具有8到30个碳原子的分支羧酸或者在优选的情况下为8到30个碳原子的直链的羧酸。该底物分布的本专利技术的变化可在全部长度(即，C8-C30)或者仅在某些部分上显示，例如对于C8-C12、C10-C12、C12-C30、C12-C25或C12-C20的羧酸或者来自这些部分的单个羧酸。可能提及的根据本专利技术可被羟化的羧酸的非限制性的例子为辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、十八烷酸、十九烷酸、二十烷酸、廿二烷酸、二十四烷酸、二十六烷酸以及三十烷酸。适当的羧酸衍生物的例子为C1-C4烷基酯、酰胺或者酐，在优选的情况下它们具有短链的C1-C4羧酸。本专利技术的单加氧酶在优选的情况下衍生自细胞色素P450单加氧酶，该P450单加氧酶来自E.C.1.14.-.-类别的酶，特别来自P450家族CYP102，并且该单加氧酶为真核或者原核来源，特别是细菌来源。这些突变体的一个特别优选的群体来自巨大芽孢杆菌细胞色素P450单加氧酶BM-3，其氨基酸序列见SEQ ID NO2，该序列具有至少一个在下列氨基酸序列区域之一的功能性突变，24-28、45-51、70-72、73-82(螺旋5)、86-88(螺旋6)、172-224(F/G转角(loop))以及352-356(β-strand 8)，这些突变的前提是如果该酶具有突变F87A，则这些区域中的多个被突变，该群体还来自这些突变体的功能性等价物。在本描述中，所讨论的突变以氨基酸单字母编码表示。原氨基酸在显示该突变的序列位置的数字前标示，而变动的氨基酸在该数字后标示。“功能性突变”根据本专利技术的目的包括在上述区域的一种氨基酸交换，该交换导致一种上文定义的“变化的反应模式”或“变化的底物分布”。根据本专利技术，P450 BM-3单加氧酶突变体(群体(A))是优选的，在氨基酸区域86-88、172-224、73-82、45-51以及24-28(根据SEQ IDNO2)，该突变体单独地或组合地至少在每种情况下含有一种功能性突变。由此，例如，Phe87可以被具有脂肪族侧链的氨基酸替换，如Ala、Val、Leu，特别是Val或者Ala；Leu188可以被具有一个氨基或者氨基侧链的氨基酸替换，如Asn、Gln、Arg或者，特别是Lys，或者诸如Ala、Gly、Ser以及Trp这样的氨基酸；Ala74可以被具有脂肪族侧链的另一种氨基酸替换，如Val，特别是Gly；Arg47可以被一种具有环状侧链基团的氨基酸替换，如His、Try或者，特别是Phe；Val26可以被一种具有羟基侧链基团的氨基酸替换，如Ser或者，特别是Thr。优选的群体群体(A)突变体表现出至少一种以下的氨基酸替换模式a)F87V；b)F87A，L188K；c)F87V，L188K；d)F87A，L188K；A74G；e)F87V，L188K，A74G；f)F87A，L188K，A74G，R47F；g)F87V，L188K，A74G，R47F；h)F87A，L188K，A74G，R47F，V26T；或i)F87V，L188K，A74G，R47F，V26T；以及它们的功能性等价物。适当的突变体的一个进一步的群体，群体(B)在上述的序列区域之一或者在序列区域70-72以及352-356之一中表现出一个单独的氨基酸替换。在这两个刚刚提及的序列区域内，Ser72，例如，可以被具有脂肪侧链的氨基酸替换，如Ala、Val、Leu、Ile以及，特别地，Gly，并且Met354可被具有羟基侧链基团的氨基酸替换，例如，Ser，或者，特别地，Thr。特别地，群体B表现出来自以下的一个氨基酸替换a)V26T，b)R47F，c)S72Gd)A74G，e)F87Vf)L188z，其中z为K、R、W、Q、N、G、A或S以及g)M354T；以及它们的功能性等价物。“功能性等价物”应被理解作根据本专利技术的突变体的意思，这些突变体在上述的序列位点中的至少一个上表现出一种氨基酸替换，该替换不同于具体提到过的替换，但仍然可产生一种突变体，该突变体同具体提及的突变体一样对于野生型表现出上文定义的“变化的底物分布”。功能性等价物特别在该反应模式的变化在质上相应的情况下存在。“功能性等价物”还自然地涵盖P450单加氧酶突变体，该突变体与具体提及的P450 BM3突变体类似，可通过对来自其它生物体的P450酶进行突变而获得。例如，同源序列区域可通过序列比较而鉴别。根据在本专利技术具体建立的原理，分子构模(molecular modeling)的现代方法允许进行影响本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经修饰的细胞色素Ｐ４５０单加氧酶，由于该酶底物结合区域的位点特异诱变，同野生型相比该酶在对脂肪族羧酸的末端和／或次末端的酶促羟化上表现出变化的底物分布（Ｓｕｂｓｔｒａｔｐｒｏｆｉｌ）。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：B豪尔，J普莱斯，U施瓦尼贝格，J施密特，M菲舍尔，R施密德，QS李，
申请(专利权)人：BASF公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]