在丝状真菌中发挥作用的调控序列和表达体系制造技术

本发明专利技术提供在属于无孢纲（Ａｇｏｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）的丝状真菌、特别是在无孢菌类（Ｍｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ）中能够与内源基因的表达协同发挥作用的启动子和终止子。上述启动子含有序列号１所示的核苷酸序列或其同系物。上述终止子含有序列号２所示的核苷酸序列或其同系物。本发明专利技术还提供在丝状真菌中高效表达目的蛋白的表达载体，能够高效生产目的蛋白的转化丝状真菌，以及由转化丝状真菌生产目的蛋白的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及在丝状真菌中发挥作用的启动子和终止子，含有它们的表达载体，以及用该载体转化的宿主。
技术介绍
丝状真菌PF1022菌株(无孢菌类，Mycelia sterilia)(FERM BP-2671)产生具有驱虫活性的24员环状缩肽PF1022物质。该菌株由于不能形成有性和无性的生殖器，分类上归于无孢纲(Agonomycetes)(特开平3-35796)。通过将连接了抗药性基因和来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的高淀粉酶基因的质粒导入PF1022菌株，可以获得PF1022菌株的转化体(WO97/00944号)。而WO97/00944号公报所示的来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的高淀粉酶基因的调控DNA序列是来自异源菌株的调控DNA序列。而且无孢菌类(Mycelia sterilia)其遗传学上的特性不十分清楚，适于表达载体体系的条件也不清楚。因此，有关使用来自异源菌株的调控序列的转化体是否能与存在于PF1022菌株的基因表达进行协同表达调控还不清楚。另外，由于PF1022菌株属于无孢纲，因此对曲霉(Aspergillus)属以外的木霉(Trichoderma)属、镰刀霉(fusarium)属以及链孢霉(Neurospora)属等中使用的以往的调控DNA序列是否适于表达调控同样不清楚。由此，希望确立能够在无孢菌类中稳定发挥作用的调控序列以及表达载体体系，以及在利用它们的、在无孢菌类中生产有用物质的生产技术。专利技术概述本专利技术的目的在于，提供在属于无孢纲的丝状真菌、特别是在无孢菌类(Mycelia sterilia)中能够与内源基因的表达协同发挥作用的调控序列。本专利技术的第二个目的在于，提供在属于无孢纲的丝状真菌、特别是在无孢菌类(Mycelia sterilia)中高效表达目的蛋白的表达载体。本专利技术的第三个目的在于，提供能够高效生产目的蛋白的、转化的属于无孢纲的丝状真菌、特别是无孢菌类(Mycelia sterilia)。本专利技术的第四个目的在于，提供在属于无孢纲的丝状真菌、特别是在无孢菌类(Mycelia sterilia)中制造目的蛋白的方法。本专利技术人等在分离、鉴定可在PF1022菌株中高效表达的基因(Abp1基因)及其调控DNA序列方面获得了成功。另外，本专利技术人在使用获得的调控DNA序列，构建基因表达用的表达载体，并将其导入PF1022物质生产菌，获得转化体，使连接在启动子下游的目的基因在不损害其功能的同时进行有效表达方面也获得了成功。本专利技术的启动子是含有选自以下序列构成的组的核苷酸序列的启动子，以及具有启动子活性的该核苷酸序列片段。(a)序列号1的核苷酸序列，(b)与序列号1的核苷酸序列至少具有70％的同源性，而且具有启动子活性的核苷酸序列，(c)序列号1的核苷酸序列的修饰体，该序列具有1个以上选自置换、缺失、附加和插入的修饰，而且具有启动子活性，(d)在严格条件下与序列号1的核苷酸序列杂交，而且具有启动子活性的核苷酸序列。本专利技术的终止子是含有选自以下序列构成的组的核苷酸序列的终止子，以及具有终止子活性的该核苷酸序列片段。(e)序列号2的核苷酸序列，(f)与序列号2的核苷酸序列至少具有70％的同源性，而且具有终止子活性的核苷酸序列，(g)序列号2的核苷酸序列的修饰体，该序列具有1个以上选自置换、缺失、附加和插入的修饰，而且具有终止子活性，(h)在严格条件下与序列号2的核苷酸序列杂交，而且具有终止子活性的核苷酸序列。本专利技术的表达载体是含有上述启动子或其片段和上述终止子或其片段两者或任一方的表达载体。本专利技术的转化宿主是用上述表达载体转化的宿主。本专利技术的目的物质的制造方法，包括培养上述转化宿主，然后从培养物中提取目的蛋白质的步骤。附图的简单说明附图说明图1表示含有Abp1基因的6kb的Hind III片段的限制酶图谱。图2表示pABPd的结构及其限制酶图谱。专利技术的具体实施方案微生物保藏PF1022菌株于1989年1月24日委托通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所(日本国茨城县筑波市东1丁目1-3号)保藏，保藏编号为FERM BP-2671。调控序列本专利技术提供在PF1022生产菌中发挥作用的调控序列，即，启动子和终止子。在序列(b)中，与序列号1的核苷酸序列的同源性优选至少为80％，更优选至少为90％，最优选至少为95％。在序列(f)中，与序列号2的核苷酸序列的同源性优选至少为80％，更优选至少为90％，最优选至少为95％。在序列(c)和(g)中，修饰的核苷酸数目例如可以为1～数十个。在序列(c)和(g)中，存在多个修饰时，导入的修饰的种类可以相同也可以不同。在序列(d)和(h)中，“严格条件”是指杂交后膜的洗涤操作在高温、低盐浓度溶液中进行，例如0.5×SSC浓度(1×SSC15mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠)、于60℃、15分钟的洗涤条件，优选在0.5×SSC浓度、0.1％SDS溶液中，于60℃、15分钟的洗涤条件。具有启动子活性的片段，其长度至少为600碱基对，优选至少为800碱基对，更优选至少为1000碱基对，最优选至少为1200碱基对。具有终止子活性的片段，其长度至少为400碱基对，优选至少为600碱基对，更优选至少为800碱基对，最优选至少为1000碱基对。就序列(b)、(c)、(d)以及具有启动子活性的片段是否“具有启动子活性”，例如可以通过构建实施例3所述的表达载体，如实施例4所述的那样将异源基因在宿主中表达，并通过检测异源蛋白的生成来进行评价。就序列(f)、(g)、(h)以及具有终止子活性的片段是否“具有终止子活性”，例如可以通过构建实施例3所述的表达载体，如实施例4所述的那样将异源基因在宿主中表达，并通过检测异源蛋白的生成来进行评价。本专利技术的启动子和终止子可以在无孢纲的丝状真菌、特别是菌丝体类(Mycelia)微生物，更具体来说可以在无孢菌类(Myceliasterilia)微生物中发挥作用。本专利技术的启动子和终止子可以在PF1022生产菌中发挥作用。作为PF1022生产菌，例如生产PF1022物质的、分类上归于无孢纲的丝状真菌。本专利技术的启动子和终止子例如可以通过以下操作获得。从产生PF1022物质时的细胞分离PF1022株的mRNA，以它作为模板，合成cDNA。对其进行随机筛选，进行碱基序列解析，对表达频率高的基因，即，来自Abp1基因的cDNA进行分离。从PF1022株提取基因组DNA，用适当的限制酶酶切后，使用噬菌体载体或质粒载体，构建由PF1022物质生产菌的基因组DNA组成的文库。用编码Abp1基因的翻译区作为探针，从来自PF1022株的上述基因组DNA文库克隆全长Abp1基因。对纯化的基因组DNA和上述cDNA碱基序列进行比较研究，确定该基因的启动子和终止子部位，作为启动子和终止子。表达载体本专利技术提供含有可在PF1022物质生产菌中发挥作用的调控序列的表达载体。本专利技术的表达载体的构建程序和方法可以使用基因工程领域中惯用的程序和方法。作为可用于本专利技术的表达载体，例如整合在宿主染色体DNA的载体，以及以质粒状态存在于宿主细胞内的具有可自主复制的自主复制序列的载体，如pUC系列(pUC18或pUC118等)、pBlues本文档来自技高网...

【技术保护点】
含有选自以下序列构成的组的核苷酸序列的启动子，以及具有启动子活性的该核苷酸序列片段；（ａ）序列号１的核苷酸序列，（ｂ）与序列号１的核苷酸序列至少具有７０％的同源性，而且具有启动子活性的核苷酸序列，（ｃ）序列号１的核苷酸序列的修饰 体，该序列具有１个以上选自置换、缺失、附加和插入的修饰，而且具有启动子活性，以及（ｄ）在严格条件下与序列号１的核苷酸序列杂交，而且具有启动子活性的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：渡边学，村上健，
申请(专利权)人：明治制果株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]