hMCP-DAF融合基因及其编码的多肽和构建方法技术

本发明专利技术公开了一种融合基因及其编码的多肽和构建方法。它包括编码具有ｈＭＣＰ－ＤＡＦ融合基因多肽的核苷酸序列，该融合基因在Ｃ３／Ｃ５水平阻断补体的级联反应，抑制或减弱人补体对猪器官的攻击，使异种移植的器官逃脱超急性排斥反应的作用效果优于单个基因，因此，它在异种器官移植中会发挥更好的作用。融合基因构建方法是在设计ＰＣＲ引物时，将同一种限制性内切酶的酶切位点分别引入两个基因的连接区，并添加一段柔性的连接肽序列，然后分别通过ＰＣＲ反应扩增两个基因，用相同的限制性内切酶酶切两个基因，再用ＤＮＡ连接酶将两个基因融合。构建融合基因所用的连接肽ＤＮＡ序列长３０ｂｐ，编码的氨基酸序列由８个甘氨酸和２个丝氨酸组成，这有利于两个基因所编码的蛋白质保持各自原有的构象，不影响融合蛋白活性的发挥。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物领域，尤其涉及hMCP-DAF融合基因及其编码的多肽和构建方法。
技术介绍
器官移植被证明是一个拯救和延长生命的有效办法，有时还是唯一的办法。在世界范围内，人类同种器官移植始于50年代。但世界范围内供体器官的短缺一直困扰着器官移植的临床研究与应用，世界各大医院每年都有许多等待不到器官移植的人死亡。这种状况一直刺激着科学家对非人源器官移植的可能性研究，这种研究自八十年代后期成为一世界性热点。几个世纪以来，医生们一直在试着用动物的器官来复原病人。这的确有很多优点，一是动物器官“取之不尽”；二是动物器官比起人类器官来，对人体更自然和更具生物性；三是异种器官可以“随要随取”，而人类器官即使有人提供，也有不便久存的难题。科学家采用血缘关系较近的物种如狒狒和黑猩猩，取得了最佳进展。狒狒的肝脏曾使人类存活到71天，而换了黑猩猩肾的人则活得长达9个月。然而，没有一种人类近亲显示出作为人类器官提供者的前途。狒狒的器官太小，不能长期支撑人体；黑猩猩太珍稀，又和人类血缘太近，不能按常规那样屠宰制成备用器官。而且任何灵长类动物都可能携带着致命的感染源。正如哈佛的微生物学家罗纳德·德斯罗西亚斯解释的“在进化尺度上与人类越近的物种，所携带新病原体之风险越大。”想想人类的爱滋病病毒最初便是在黑猩猩和猴子上发源的，既便是最热衷近亲移植的人现在也同意，我们应开发与人类有一定距离的“器官捐献者”了。猪是人类临床异种器官移植的首选供体。首先，猪在体重和生理上与人类似。再者，猪的数量多，易于繁殖和饲养。还有它是非灵长类，不会像黑猩猩和狒狒那样引发较多伦理和安全性方面的关注。如今医生已在利用各种猪的配件，如心脏瓣膜、凝集团子、胰岛细胞，甚至大脑细胞来治疗人类的各类疾患。但异种器官移植将受到各种免疫机制的排斥，其中有超急性反应(HAR)、急性血管排斥和细胞排斥等。发生超急性排斥是由补体系统的免疫反应引起的，猪的内皮细胞具有糖类表面抗原Galal-3Galal-4GlcNAc-R(aGAL)，器官移植后，被人血清中预存的天然抗体(XNA)所识别，发生特异性结合，触发补体分子的活化，经各级补体反应，形成攻膜复合体(MAC)，针对异种组织发生细胞裂解作用，导致异种移植器官的炎症和血栓形成，使猪器官在十几分钟到几小时内就被排斥，即发生超急性排斥(HAR)。补体系统由12种激活蛋白组成，分别构成两条分支激活途径和最终合一的作用途径，其中C3转化酶的激活是补体系列反应中最关键的一步。衰败加速因子(DAF)和膜辅助蛋白(MCP)是人类补体调节蛋白基因家族中的成员，它们和CRP家族中的其它成员(CR1、CR2、类CR1、类CR2等)一起呈簇状排列在人染色体1q32上。DAF可解离C3转化酶中的催化亚基，MCP间接地使结合亚基裂解和失活，从而抑制C3转化酶的装配。应用转基因技术获得转基因猪，使供体表达人类补体调节蛋白DAF和MCP，这样供体器官能在C3/C5水平了阻断补体的级联反应，抑制或减弱人补体对猪器官的攻击，使异种移植的器官逃脱超急性排斥反应(HAR)。1995年，Kooyman、Diamond、Byrne分别实现了人CD59基因、MCP基因、DAF基因在小鼠中的表达，使小鼠的器官具有对人补体攻击的抗性。White等(1998)将10例hDAF转基因猪心脏移植到受免疫抑制的猕猴体内，异种心脏存活了3-62天。魏庆信等(1999)也获得表达hDAF的转基因猪，并进行猪—猴心脏移植，超急性排斥基本得到了控制。Yannoutsos(1996)利用YAC载体构建了表达hMCP的转基因小鼠模型，验证能显著阻止人血清引起的超急性排斥反应。白成等(1999)也证实表达hMCP的猪内皮细胞可抑制人血清补体的细胞毒作用。Daggett(1997)将3例hMCP转基因猪肺移植给狒狒，其存活时间延长至12小时。但人类补体的级联反应是一种由多基因作用的，复杂的生理过程；在转基因猪中表达单个基因的调控蛋白，虽能明显减弱或抑制超急性排斥反应，但其效果不完全理想。据报道，MCP和DAF在功能上密切相关，且MCP+DAF的作用效果优于单个基因。因此，培育能表达几个或一组人补体调控蛋白的转基因猪就成为新的突破口。本专利技术的目的在于在完成MCP和DAF基因克隆和测序基础上，把MCP和DAcDNA进一步连接成融合基因，相互间以富含Gly和Ser的10aa编码序列作柔性铰链连接，构建成国内首例具有起始、终止密码及正确阅读框架、长度为2120b的hMCP-DAF融合基因，为以后MCP和DAF融合基因的转基因动物的研究创造条件。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供两个基因的融合方法，该方法为在设计PCR引物时，将同一种限制性内切酶的酶切位点分别引入两个基因的连接区(即一个基因的PCR下游引物和另一个基因的PCR上游引物)，并添加一段柔性的连接肽序列(Linker)。然后分别通过PCR反应扩增两个基因，用相同的限制性内切酶酶切两个基因，再用DNA连接酶将两个基因融合。本专利技术目的之二是提供融合两个基因的柔性连接肽的DNA序列，该序列长30bp，序列为GGC-GGT-GGT-GGG-TCT-GGT-GGT-GGC-GGC-TCG，连接肽DNA序列编码10个氨基酸，序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，由8个甘氨酸和2个丝氨酸组成。本专利技术目的之三是提供新的融合基因hMCP-DAF的cDNA序列，全长为2120bp，编码区为11-2113bp。在融合基因中，1-955bp来自MCP基因(原MCP基因96～1050bp)，序列长为955bp；956-985bp为连接肽的DNA序列，共30bp；986-2120bp来自DAF基因(原DAF基因段的82～1216bp)，序列长为1135bp。本专利技术目的之四是提供hMCP-DAF融合基因的氨基酸序列，融合基因MCP-DAF编码区为11-2113bp，具有起始、终止密码子及正确阅读框架，共编码700个氨基酸残基。其中，MCP段的编码序列是第11-955bp，编码315个氨基酸残基；连接肽位置在第956-985bp，编码10个氨基酸残基；DAF段的编码序列是第986-2114bp，编码375个氨基酸残基。本专利技术目的之五是提供hMCP-DAF融合基因，其特征在于舍去了MCP的3’端跨膜疏水区，而保留MCP信号肽段；弃去了DAF的信号肽序列，而完整保留了DAF的GPI锚和跨膜疏水区；同时保留MCP和DAF各自的STP区。本专利技术目的还提供了含MCP-DAF融合基因的重组载体、含重组载体的宿主细胞。本专利技术的优点1)融合基因构建方法简单，只需通过PCR扩增目的基因、酶切PCR产物和连接酶连接就可完成。2)在构建融合基因时，采用长30bp的连接肽DNA序列，它编码10个氨基酸，氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，由8个甘氨酸和2个丝氨酸组成，这有利于保持两个基因所编码的蛋白质保持各自原有的构象，不影响融合蛋白活性的发挥。3)MCP和DAF在功能上密切相关，能在C3/C5水平了阻断补体的级联反应，抑制或减弱人补体对猪器官的攻击，使异种移植的器官逃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建的人补体膜辅助调节蛋白和促衰变因子融合基因的ｃＤＮＡ序列，其特征在于：它包括：编码具有ｈＭＣＰ－ＤＡＦ融合基因多肽的核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：俞颂东，乔守怡，杨岐生，崔秀璟，李卫芬，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]