新型(R)-2-羟基-3-苯基丙酸(D-苯基乳酸)脱氢酶及其编码基因制造技术

本发明专利技术提供的Ｄ－苯基乳酸脱氢酶是一种具有ＳＥＱＩＤＮＯ：２提供的氨基酸序列或由选自取代、缺失、添加和插入的一个或多个修饰衍生所述氨基酸序列产生的氨基酸序列并且具有Ｄ－苯基乳酸脱氢酶活性的蛋白质。本发明专利技术提供一种包含编码Ｄ－苯基乳酸脱氢酶的核苷酸序列的基因，所述核苷酸序列例如ＳＥＱＩＤＮＯ：１提供的核苷酸序列。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
新型(r)－2－羟基－3－苯基丙酸(d－苯基乳酸)脱氢酶及其编码基因的制作方法 专利技术背景已知由微生物产生的某些种类的酶特异性产生具旋光性化合物，例如D-乳酸(Taguchi，H.等，J.Biol.Chem.，266，12588(1991))。此外，已有许多关于用某些种类的酶或产生有用的酶的微生物生产工业用化合物(例如(R)-2-羟基-4-苯基丁酸)方法的报道(日本专利号2750017，日本专利号2752754，日本专利号2774341，日本专利号2873236，日本专利公告号61271/1994，日本专利公开号197774/1994，和日本专利公开号75797/1998)。酶促反应的特征在于其比化学合成产生选择性和有效性更高的目标化合物。另一方面，因为每一种酶的底物特异性严格，所以必需寻找特异性作用于目标化合物的酶。迄今为止，没有报道过特异性针对微生物产生的D-苯基乳酸的脱氢酶。专利技术概述本专利技术者已成功分离出一种特异性还原苯基丙酮酸并产生D-苯基乳酸的酶(即D-苯基乳酸脱氢酶(D-PLDH)和编码该酶的基因。此外，本专利技术者已成功在大肠杆菌(Escherichiacoli)中大量表达该基因。本专利技术的目的之一是提供一种D-苯基乳酸脱氢酶。本专利技术的另一目的是提供编码该D-苯基乳酸脱氢酶的基因。本专利技术再一目的是提供用于表达D-苯基乳酸脱氢酶的重组载体和转化体，以及一种生产D-苯基乳酸脱氢酶的方法。本专利技术的再一个目的是提供PF1022物质和其衍生物的大规模生产体系及其生产方法。本专利技术的D-苯基乳酸脱氢酶是一种包含选自下列序列的氨基酸序列的蛋白质(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列，和(b)SEQ ID NO2氨基酸序列的修饰氨基酸序列，它具有选自替换、缺失、添加和插入的一种或多种修饰，并具有D-苯基乳酸脱氢酶活性。本专利技术的D-苯基乳酸脱氢酶基因包含编码所述D-苯基乳酸脱氢酶的核苷酸序列。此外，本专利技术的D-苯基乳酸脱氢酶基因包含选自下列序列的核苷酸序列(c)SEQ ID NO1的DNA序列，(d)与SEQ ID NO1的DNA序列具有至少70％同源性的核苷酸序列，并且它编码具有D-苯基乳酸脱氢酶活性的蛋白质，(e)SEQ ID NO1的DNA序列的修饰DNA序列，它具有选自替换、缺失、添加和插入的一种或多种修饰，并且编码具有D-苯基乳酸脱氢酶活性的蛋白质，(f)与SEQ ID NO1的DNA序列在严格条件下杂交的核苷酸序列，并且它编码具有D-苯基乳酸脱氢酶活性的蛋白质。本专利技术的重组载体包含本专利技术的D-苯基乳酸脱氢酶基因。本专利技术的转化体是一种包含本专利技术重组载体的宿主。本专利技术的D-苯基乳酸脱氢酶生产方法包括以下步骤培养本专利技术的转化体；从培养基中收集所述D-苯基乳酸脱氢酶。本专利技术的PF1022物质生产体系是用本专利技术重组载体转化的产生PF1022物质的微生物。本专利技术的PF1022物质生产方法包括以下步骤培养用本专利技术的重组载体转化的产生PF1022物质的微生物，从培养基中收集所述物质。附图简述图1说明质粒pDPLDH-1的构建方法。专利技术详述微生物保藏实施例1-1所述PF1022菌株保藏于国际专利生物保藏单位国立高级工业科学技术研究院(Tsukuba Central 6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba，Ibaraki，Japan)，保藏日期为1989年1月24日。保藏号为FERM BP-2671。用实施例3-3所述质粒pDPLDH-1转化的大肠杆菌(DH5α)菌株保藏于国际专利生物保藏单位国立高级工业科学技术研究院，保藏日期为2000年4月12日。保藏号为FERM BP-7545。基因和蛋白质本专利技术提供一种D-苯基乳酸脱氢酶及其基因。本专利技术的酶作用于2-氧代-3-苯基丙酸(下文有时称为“苯基丙酮酸”)并将其还原转变为(R)-2-羟基-3-苯基丙酸。通过预先修饰底物苯基丙酮酸能制备D-苯基乳酸的衍生物或类似物。D-苯基乳酸衍生物的实例包括对氨基苯基乳酸、对-硝基苯基乳酸和对-羟基苯基乳酸。这样，例如对氨基苯基丙酮酸、对-硝基苯基丙酮酸和对-羟基苯基丙酮酸能用作合成D-苯基乳酸衍生物的底物。D-苯基乳酸类似物的实例包括用作抗高血压剂原料的(R)-2-羟基-4-苯基丁酸。这样，例如2-氧代-4-苯基丁酸可用作合成D-苯基乳酸类似物的底物。例如在序列(b)中，修饰数量可以是一至数个，更准确地说可以为1-6个。例如在序列(e)中，修饰数量可以是1-12个。在序列(b)和序列(e)中，可引入相同的或不同的多个修饰。序列(d)与SEQ ID NO1的DNA序列的同源性优选为至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％。在序列(f)中，术语“严格条件”指在低浓度盐溶液中高温洗涤杂交膜，例如在0.2×SSC浓度(1×SSC15mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠)的0.1％SDS溶液中于60℃洗涤15分钟。对于序列(b)，可以测定它是否“具有D-苯基乳酸脱氢酶活性”，例如通过为所述D-苯基乳酸脱氢酶提供一种底物(如苯基丙酮酸)和一种还原型辅酶，即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，使所要测试的蛋白发生反应，然后测量酶反应引起的物理化学变化，例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的光密度变化和/或产物(即D-苯基乳酸)的数量变化(参见实施例3)。对于序列(d)、(e)和(f)，可以测定它们是否“编码具有D-苯基乳酸脱氢酶活性的蛋白质”，例如通过在宿主中表达所测试的核苷酸序列，将产生的蛋白与D-苯基乳酸脱氢酶的底物(如苯基丙酮酸)和一种还原型辅酶(即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH))反应，然后测量酶反应引起的物理化学变化，例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的光密度变化和/或产物(即D-苯基乳酸)的数量变化(参见实施例3)。如果已知本专利技术所述酶的氨基酸序列，容易测定编码该酶的核苷酸序列，并且可以选择编码SEQ ID NO2所述氨基酸序列的各种核苷酸序列。因此，除SEQ ID NO1的DNA序列的部分或全部外，编码本专利技术酶的核苷酸序列包括编码同样的氨基酸序列并具有简并密码子的任何DNA序列，还包括上述序列的相应RNA序列。本专利技术酶和基因的来源没有特别限制，可使用任何能产生本专利技术酶的微生物；优选产生PF1022物质的微生物(无孢菌类(Myceliasterilia)，FERM BP-2671)。可测定本专利技术酶的N-末端氨基酸序列，例如将该酶进行SDS-聚丙烯酰胺电泳，将所得酶带电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜或同类的膜上，然后通过蛋白测序分析对其进行分析。可测定本专利技术酶的内部氨基酸序列，例如用蛋白酶或同类的酶部分消化该酶，然后在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行上述步骤和用反向层析的分离步骤。例如本专利技术的基因可以如下获得。从产生PF1022物质的微生物中提取基因组DNA并用合适的限制酶裂解，然后用噬菌体载体构建包含产生PF1022物质的微生物基因组DNA的文库。另外，从产生PF1022物质的微生物中提取总RNA，以寡聚dT作引物通过反转录酶反应制备mRNA相应的cDNA，然后用噬菌体载体构建包含产生PF1022物质的微生物cDNA的文库。根据D-PLDH N-末端氨基酸序列和内部氨基酸序列合成合适的引物。用这些引物并以来自本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质，它包含选自下列序列的氨基酸序列： （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２的氨基酸序列， （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２氨基酸序列的修饰氨基酸序列，它具有选自取代、缺失、添加和插入的一个或多个修饰并且具有Ｄ－苯基乳酸脱氢酶活性。

【技术特征摘要】
JP 2000-4-26 125449/001.一种蛋白质，它包含选自下列序列的氨基酸序列(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列，(b)SEQ ID NO2氨基酸序列的修饰氨基酸序列，它具有选自取代、缺失、添加和插入的一个或多个修饰并且具有D-苯基乳酸脱氢酶活性。2.一种多核苷酸，它编码权利要求1的蛋白质。3.权利要求2的多核苷酸，它包含SEQ ID NO1的DNA序列。4.一种多核苷酸序列，它选自下列序列(c)SEQ ID NO1的DNA序列，(d)与SEQ ID NO1的DNA序列的同源性至少为70％并且编码具有D-苯基乳酸脱氢酶活性的蛋白质的核苷酸序列，(e)SEQ ID NO1的DNA序列的修饰DNA序列，它具有选自取代、缺失、添加和插入的一个或多个修饰并且编码具有D-苯基乳酸脱氢酶活性的蛋白质，(f)在严格条件下与SEQ ID NO1的DNA序列杂交并且编码具有D-苯基乳酸脱氢酶活性的蛋白质核苷酸序列。5.权利要求4的多核苷酸，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫本功一，隅田奈绪美，御堂直树，村上健，R佐彻尔，H克雷恩考夫，
申请(专利权)人：明治制果株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]