通过增加底物转运增强工业生产制造技术

本发明专利技术涉及一种增强宿主细胞生产期望的化合物的方法，该宿主细胞中此化合物的合成至少有部分的细胞内途径。这种方法包含选择宿主细胞，其具有至少一个使用细胞外底物的细胞内合成途径；增加该细胞外底物进入该宿主细胞的转运，且保持宿主细胞的完整性，培养宿主细胞使用该细胞外底物生产；合成期望的化合物。底物的转运增加通过给宿主细胞转化编码一或多种将底物转运到细胞内的酶的基因来完成。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般地涉及增强期望的终产物的生物转变，特别地涉及过量表达转运蛋白以促进底物从一个细胞部位穿膜转运到另一个细胞部位。本专利技术提供了在微生物中增强期望的终产物生产的表达载体、方法和系统。
技术介绍
生物膜的脂双层通常对离子和极性分子是非通透性的。这些生物膜构成了细胞的区室，使细胞的不同部分相互隔开。因而被细胞利用以合成各种产物的底物以及被细胞利用以生成能量或生长的代谢物可与利用它们的合成和/或代谢反应分隔开。至于产物的合成，不同的合成途径或其部分可发现于在细胞的不同部分。一些氧化反应可发生在细胞溶胶的外面。例如，膜结合蛋白质可用于将碳源氧化为其他中间物。胞质反应或途径例如一些还原或脱氢作用也可用来将底物或中间物转变为另一种产物。当底物和合成装置位于膜的相反侧时，期望的产物的生产需要底物转位到合成反应的位置以使其能够转变为终产物。换句话说，在细胞膜内部生成的终产物需要从细胞内转位。由于细胞隔开的部分可能具有不同的环境参数例如溶质、离子、终产物等，浓度或者需要穿过通常非通透性的膜障碍物转运，所以需要一些形式的主动转运。针对这些问题，出现了关于增加材料跨膜转运的研究。已用溶剂或裂解试剂来使膜破裂，以使得材料能够跨过膜。然而，这样的方法具有不利于宿主细胞生存力的作用。如果合成或代谢途径依赖于宿主细胞自身的代谢或分解代谢途径或由其提供能量，例如需要如NADH或NADPH的辅因子，那么破坏细胞的生存力即停止了宿主细胞进一步的或连续的合成生产。另外，虽然已在增加细胞生长方面探索了葡萄糖或其他糖类转运的增加(Parker，C.等人，Mol.Microbiol 15(5)795-802(1995))，但尚未认识到通过利用重组微生物的生物合成途径而改变细胞转运系统以增加化学终产物或中间物的工业生产。Cornish(J.of Gen.Microbiol.，134；3111-3122(1988))讨论了放射土壤杆菌(Agrobacteriym radiobacter)葡萄糖转运和琥珀酰聚糖(Succinoglucan)外聚糖(exopolysaccharide)生产之间的关系。Cornish提出葡萄糖的摄入是琥珀酰聚糖生产的主要动力学控制点，并且应该可能通过利用重组DNA方法获得更高的琥珀酰聚糖生产速率。然而Cornish的生产速率不在符合工业生产规模需要。此外，葡萄糖转运中的高水平能量消耗和复杂的调节机制阻碍了而不是促使该转运的使用。Volschenk，H.等人(Nat.Biotechnol.15253(March1997))描述了将苹果酸降解途径引入到酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)中，这是通过克隆和表达编码所述途径的异源DNA而耗尽酒中苹果酸水平来实现的。Volschenk主要关注从周围培养基中去除苹果酸，而并非任何期望的终产物的工业规模生产。此外，有关转运系统涉及其中的起码知识很难保证能实现期望的终产物或中间物的增强生产。合成装置可能已经饱和，因而增加的底物的存在不定导致期望的终产物增加的生产。另外，增加对除作为生产底物用途之外还被直接或间接用作代谢物的底物的转运可能不会导致期望的增加的生产。仅仅增加将底物转变为期望的终产物的酶的表达水平可能并不导致利用重组微生物的化学化合物增加的生产。需要有一种方法，能够利用重组微生物通过除增加细胞内底物表达水平之外的其它方法增加化学化合物的生产。专利技术概述微生物的底物转运装置容量可能成为期望的终产物生产的一个限制因子或瓶颈，尤其当终产物、中间物或前体生产分散在细胞的不同区域时。本专利技术提供了一种减轻所说的瓶颈的方法。本专利技术部分基于增加底物穿越细胞膜的转运可以增加期望底物的总体生产这一发现的。本专利技术也提供了增强具有至少部分细胞内途径的宿主细胞中生物合成期望化合物的改进方法。因此，提供了增强具有至少部分细胞内途径的宿主细胞中生物合成期望化合物的方法，该方法含有选择具有至少部分细胞内使用细胞外底物的合成途径的宿主细胞；增加该细胞外底物向宿主细胞的转运，且保持宿主细胞的完整性；培养宿主细胞生成该细胞外底物；生成期望的化合物。在一个优选实施方案中，该底物进入该宿主细胞的转运是该宿主细胞生物合成中的一个限速步骤。在一个优选实施方案中，宿主细胞选自克雷伯菌属(Kleibsiella)和泛菌属(Pantoea)。在本专利技术的一个优选实施方案中，增加细胞外底物进入宿主细胞的转运包括，给宿主细胞转化编码一个或多个能增加底物转运到宿主细胞内的蛋白质的DNA。在一个实施方案中，此蛋白质是转运促进物。在另一个实施方案中，此蛋白质是一个主要易化物(facilitator)超家族。然而，在另一个实施方案中，此蛋白质是阴离子/阳离子H+转运蛋白。本专利技术进一步提供了过表达底物/H+同向转运蛋白的方法，其包含选择宿主细胞和把编码一个或多个底物/H+同向转运蛋白的基因转化到该宿主细胞这些步骤。附图简述附图说明图1，表示产酸克雷伯氏杆菌(Klebsiella oxytoca)YiaX2的DNA和氨基酸序列；PE1(环境通透酶)；PE6(环境通透酶)；柠檬泛菌(Pantoea citrea)的PermA；柠檬泛菌的PermB；柠檬泛菌的YiaX2。图2是一个表示从葡萄糖生产抗坏血酸前体2-KLG的合成途径的流程图。图3是一个表示抗坏血酸前体2-酮-L-古洛糖酸(2-KLG)的合成途径的示意图。图4是一个表示可由葡萄糖得到2-KLG的各种合成途径的流程图。Boudrant，J.，Enzym Microb.Tech.，1990，12，322-329。图4A是一个表示D-山梨糖醇到2-KLG的合成途径的示意图，显示了该途径中反应相对于其他反应的细胞内定位和底物跨过细胞膜的转运。saito，Y.等人，Biotechnol.Bioeng.58(2/3)305-315(1998)。图5表示D-葡萄糖(G)到2，5-DKG再到2-KLG的合成途径，显示了该途径中反应相对于其他反应的细胞内定位和各自的底物跨过细胞膜的转运。图6是一个比较DKG转运速度与KLG生产速率的线图，显示了2，5-DKG的摄入量随时间的变化(nmoles/OD 600)(-◆-＝果糖饲料139-2a，0.0486x+0.67；-▲-＝葡萄糖饲料139-2a，y＝0.0497+0,5877；-●-＝种子烧瓶(seed flask)139-2a，y＝0.0075x+0.0569)。图7是一个产酸克雷伯氏杆菌中抗坏血酸分解代谢的yia操纵子的示意图。图8是一个表示由硅酮油转运测定测量的产酸克雷伯氏杆菌的2，5-DKG摄入量(nmo1)图(-◆-＝实验者+异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；-▲-＝ΔAyiaaX2+IPTG； ＝实验者-IPTG)图9是一个表示对来自柠檬泛菌、产酸克雷伯氏杆菌和环境来源的通透酶的选择设计的示意图。图10是一个表示产酸克雷伯氏杆菌菌株中2，5-DKG摄入活性的条线图(YiaX2、pcp1、pcp10、pcp32、pK1、环境来源#1和环境来源#6)。图11是一个表示具有各种DKG通透酶(139-2A、139-2A+PCP32、139-2A+PCP10、139-2A+PK1、139-2A+PCP1)和在相同质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增强宿主细胞中衍生自其中至少部分细胞内途径的期望化合物的生物合成生产的方法，该方法包含：ａ）选择含有利用胞外底物的至少部分细胞内途径的宿主细胞；ｂ）在维持宿主细胞的完整性时增加所说的细胞外底物向该宿主细胞的转运；ｃ）培养该宿 主细胞以生产所说的细胞外底物；和ｄ）生产期望的化合物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M库玛，F瓦勒，
申请(专利权)人：金克克国际有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]