重组人血小板源生长因子的发酵方法技术

一种发酵生产重组人血小板源生长因子（ｒｈＰＤＧＦ－ＢＢ）的方法，包括：１）构建含重组血小板源生长因子目的基因的高效表达工程菌株，２）一级种子的培养，３）二级种子的培养，４）上罐发酵，５）收集上清，进行纯化，其特征在于，在上罐发酵过程中，参数设置为ｐＨ值为４．５－６．５，溶氧值为不小于１８％，生长期温度为２８℃－３０℃，诱导期温度为１８℃－２３℃。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种重组人的细胞因子的发酵生产方法，具体地，本专利技术涉及一种新的发酵生产重组人血小板源生长因子(rhPDGF-BB)的方法。
技术介绍
糖尿病是全球性高发疾病之一。1998年的统计数字显示，全球糖尿病患者约有1.43亿人。美国目前大约有1600万人患有糖尿病，中国糖尿病人更是高达4000多万，并且还以每年1‰的速度递增。据WHO专家估计，到2025年全球糖尿病患者将达3亿，其中75％的糖尿病人在印度、中国等发展中国家。糖尿病人的一个特殊问题是足部及下肢发生溃疡，简称糖尿病足(干性坏疽)。周边神经病变、肢端缺血和感染是三个主要的致病因素。其发病率随着患者年龄增加而增大，多发于40岁以上的患者中。糖尿病足很难治愈，目前临床主要有维持、预防感染和营养神经三种治疗方法，但都无法从根本上使组织再生，促进创面愈合。病人的溃疡长期不能愈合，甚至迟迟无皮肤生长的现象，并发感染，最终的结果是截肢。据统计，美国每年由各种类型糖尿病导致截肢的有5.6万人，单是住院治疗和截肢的总费用平均每人就需要4万美元，为此美国每年支出的医疗费用超过22亿美元，给家庭和社会带来极大负担。而血小板源生长因子可以促进创面组织再生，增加糖尿病足的治愈率，降低截肢的危险。血小板源生长因子(Platelet-Derived Growth Factor，以下简称PDGF)是一种通常储存于血小板α颗粒中的碱性蛋白质，由血小板、趋化到受损部位的巨噬细胞、受损血管附近的平滑肌细胞和受损部位的血管内皮细胞等多种细胞所分泌，具有促进中胚层源细胞分裂；刺激白细胞、平滑肌细胞、单核细胞和成纤维细胞的趋化作用；参与创伤修复过程中的炎症的反应，参与组织和细胞的分化与增殖过程；对正常和病理状态下的创伤修复有促进作用等。PDGF是由A、B两种单体构成的二聚体结构，其分子量为28-31KDa，可形成PDGF-AA，BB和AB三种异构体，在人类血小板来源中约85％-90％为AB型(分子量为22.5KDa，其中A链为13.3KDa，B链为12.2KDa)，约10％-15％为BB型。老年人的血小板也可含有多量的PDGF-BB，高达30％，而新鲜的血小板也可含有高达27％PDGF-AA。PDGF亚型的浓度是直接与创口愈合过程相关的。本专利技术的发酵工艺涉及的是重组血小板源生长因子为PDGF-BB型(以下简称为rhPDGF-BB)。大量研究表明，慢性伤口如糖尿病足部溃疡、压迫性溃疡的微环境中缺乏活性生长因子是造成它们难以愈合的主要原因。因此在这一领域中生长因子的潜在治疗作用开始受到人们的广泛关注。有关PDGF，EGF，TGF等生长因子的治疗作用迅速展开。实验表明PDGF是创伤愈合过程中较早出现的生长因子之一，在创面愈合的全过程中起重要作用，参与创口愈合的全过程。特别是针对慢性难愈性疾病如糖尿病溃疡，慢性静脉性溃疡，褥疮，放射性溃疡等效果显著。另外，血小板是进入创口的第一个细胞成分，通过释放生长因子促进平滑肌细胞胶原蛋白的合成来启动创口愈合过程。因此理论上说，PDGF应该对所有创面愈合均有促进作用，包括烧伤、烫伤、手术创口、皮外伤等急性创伤及对慢性静脉溃疡、褥疮、放射性溃疡等均有促进愈合作用。在各种疤痕的治疗方面，PDGF也显示了良好的效果，现在已经有一系列基于PDGF的用于治疗唑疮等留下的疤痕的修复用化妆品相继问世。到目前为止，PDGF是国外唯一一个在三期临床上证明有效并已作为药物上市的生长因子。1997年12月16日，美国食品及药品管理局批准Ortho-McNeil公司生产的REGRANEX药物上市，Regranex的有效活性成分是Becaplermin(0.01％)，即人重组血小板源生长因子(PDGF-BB)。Becaplermin由重组DNA技术在酵母菌中表达生产，原料Becaplermin由美国Chiron公司生产(U.S.LicenseNo.1106，Emeryville，CA 94608)；Regranex由Ortho-McNeilPharmaceutical公司推向市场(U.S.License No.1196，San German，Puerto Rico 00683)，用来治疗皮下深层、有充足血管供应的糖尿病足部溃疡。关于rhPDGF-BB的发酵工艺，据有文献报道，有人采用Pichiapastoris酵母表达系统，该系统是一种较为先进的甲基营养型酵母系统，经过十年的发展，已成为较完善的外源基因表达系统。它具有易于高密度发酵，表达基因稳定地整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌至胞外部并适当糖基化，培养方便经济等特点，而且非常适宜于扩大为工业规模。目前美国FDA已经评价来自该系统的基因工程产品，该系统被认为是安全的。(文献来自High Yield Production fromPichia pastoris YeastA Protocol for Benchtop FermentationBy Julia Cino，PhD httpwww.nbsc.com/papers/ABL_Pichia.htm)但是根据这个文献的报导，表达外源蛋白一般需要经过100-140个小时左右达到高峰。而本专利技术提供的发酵方法使得重组血小板源生长因子的蛋白表达量在诱导48-72小时后就已经达到高峰。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的发酵生产重组人血小板源生长因子(rhPDGF-BB)的方法，包括1)构建含重组血小板源生长因子目的基因的高效表达工程菌株，2)一级种子的培养，3)二级种子的培养，4)上罐发酵，5)收集上清，进行纯化，其特征在于，其特征在于，在上罐发酵过程中，参数设置为pH值为4.5-6.5，溶氧值为不小于18％，生长期温度为28℃-30℃，诱导期温度为18℃-23℃。通过该方法可以有效地缩短表达外源蛋白达到高峰所需要的时间，据有关文献报道，使用Pichia pastoris酵母表达系统表达外源蛋白一般需要经过100-140个小时左右才可以达到高峰。而本专利技术所提供的rhPDGF-BB发酵方法使得重组血小板源生长因子的蛋白表达量在诱导48-72小时后就已经达到高峰，这样就大大地缩短了发酵所需要的时间。同时纯化获得的rhPDGF-BB的纯度为大于95％，活性大于6×104μ/mg。本专利技术提供的技术方案为提供一种新的发酵生产重组人血小板源生长因子(rhPDGF-BB)的方法，包括1)构建含重组血小板源生长因子目的基因的高效表达工程菌株，2)一级种子的培养，3)二级种子的培养，4)上罐发酵，5)收集上清，进行纯化，其特征在于，在上罐发酵过程中，参数设置为pH值为4.5-6.5，溶氧值为不小于18％，生长期温度为28℃-30℃，诱导期温度为18℃-23℃。下面对本专利技术的技术方案进行具体地描述。本专利技术提供的发酵方法适用于常规分子生物学技术构建的PDGF-B的工程菌株。具体地，本专利技术提供的工程菌为，将PDGF-B基因正确置于酵母表达载体pPICZ-αA，转化酵母菌株SMD1168H，经筛选建立分泌表达rhPDGF-BB的工程菌株。然后通过常规的生产技术，进行菌株的活化，即将冻存的甘油管菌株，挑取少许涂入培养基(YPDS)中，30℃培养3天，菌落形态饱满，取出4℃保存。一级种子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卓冰，
申请(专利权)人：北京金赛狮生物制药技术开发有限责任公司，
类型：发明
国别省市：