纤维二糖水解酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种纤维二糖水解酶突变体，其活性在纤维素降解中提供降解的功能，酶为如下(a)或(b)的蛋白质：(a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第389位的苏氨酸被取代为其他氨基酸，其他氨基酸为赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有纤维二糖水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明专利技术还公开了一种组合物，其含有一种或几种酶，酶为纤维二糖水解酶突变体。本发明专利技术还公开了纤维二糖水解酶突变体或组合物于纤维素水解中的应用。本发明专利技术的纤维二糖水解酶突变体具有水解纤维素的活性，且，得到了活性提高的突变体，提高了对纤维素的水解效果。

Fiber two glucose hydrolase mutant and its application

【技术实现步骤摘要】
纤维二糖水解酶突变体及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种纤维二糖水解酶突变体，和通过基因定点突变的方法获得纤维二糖水解酶的突变体，以及纤维二糖水解酶突变体在纤维素降解中的应用。
技术介绍
由于能源危机日益严重，可再生且环保效果显著的木质纤维素糖化工艺越来越受到人们的关注。利用纤维素酶降解木质纤维素成纤维二糖，进而转化成单糖，发酵生产包括乙醇在内的生物基产品对社会经济发展具有重要的现实意义。然而，由于纤维素酶降解天然纤维素底物的效率低，成本高，因此由纤维素转化为生物燃料的过程依然具有很大挑战性。同时，由于底物的特异性，以及纤维素酶发酵液酶系的不平衡也限制了其应用。在纤维素降解过程中，纤维素酶的水解效率是纤维素转化为葡萄糖的一个瓶颈。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种纤维二糖水解酶突变体，解决终产物对纤维二糖水解酶抑制作用的问题。本专利技术还有一个目的是提供纤维二糖水解酶突变体于纤维素降解中的应用。本专利技术提供的技术方案为：一种纤维二糖水解酶突变体，所述纤维二糖水解酶突变体的活性在纤维素降解中提供降解的功能，所述酶为如下(a)或(b)的蛋白质：(a)如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的第389位的苏氨酸被取代为其他氨基酸，所述其他氨基酸为赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有纤维二糖水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。一种组合物，其含有一种或几种酶，所述酶为所述的纤维二糖水解酶突变体。这几种酶中的一种或任意几种同时用于酶系复配中从而用于降解纤维素。优选的是，所述组合物中，所述一种或几种酶均必须包含如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的第389位的苏氨酸被取代精氨酸。一种DNA分子，所述DNA分子编码所述的酶。优选的是，所述的DNA分子中，所述DNA分子的碱基序列如SEQIDNO：4所示。一种重组载体，其含有所述的DNA分子和与所述DNA分子可操作地连接的用于表达的调节序列。宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的DNA分子或所述的重组载体。一种获得所述的纤维二糖水解酶突变体的方法，包括如下步骤：步骤一、构建包含SEQIDNO：2所示的碱基序列的重组载体，该重组载体以大肠杆菌为宿主；步骤二、以步骤一中得到的重组载体为模板，分别利用如SEQIDNO:13和14所示的引物对、如SEQIDNO:15和16所示的引物对、如SEQIDNO:17和18所示的引物对、所示的引物对，通过PCR扩增得到包含SEQIDNO：4、SEQIDNO：6、SEQIDNO：8、SEQIDNO：10或SEQIDNO：12所示的碱基序列的PCR产物；步骤三、对所述PCR产物进行去甲基化处理，之后各自分别转化入大肠杆菌细胞中培养，获得含有纤维二糖水解突变体基因的重组载体。优选的是，所述的方法中，步骤三中，利用甲基化酶DpnI进行酶解对所述PCR产物进行去甲基化处理。纤维二糖水解酶突变体的生产方法，包括如下步骤：将获得的含有所述纤维二糖水解突变体基因的重组载体的宿主细胞在培养基中培养，在所述宿主细胞中生产基于重组载体所含有的纤维二糖水解酶突变体基因编码的纤维二糖水解酶突变体。所述的纤维二糖水解酶突变体或所述的组合物于纤维素水解中的应用。本专利技术至少包括以下有益效果：本专利技术的纤维二糖水解酶突变体具有水解纤维素的活性，所述水解纤维素的活性在纤维素降解中提供降解的功能，能用于降解纤维素。同时，为了提高纤维二糖水解酶的水解率，本专利技术得到纤维二糖水解酶的突变体如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的第389位的苏氨酸被取代精氨酸，提高了对纤维素的水解效果。可将其单独或与其他突变体组合使用，以提高水解效率。本专利技术的纤维二糖水解酶突变体SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的第389位的苏氨酸被取代精氨酸(T389K、氨基酸序列SEQIDNO:3)的表达量很高，且活性很高，能够用于降解纤维素。高活力的纤维二糖水解酶可用于酶系复配中，平衡水解酶系，提高转化效率。水解率的提高可以提高单位时间内纤维二糖水解酶的水解效率，降低酶用量。定义为了便于理解本专利技术，本专利技术涉及的术语和短语的含义定义如下：“反向互补”，指通过碱基配对原则关联的核苷酸序列。例如，序列“5’-A-T-G-3’”与序列“5’-C-A-T-3’”反向互补。“基因”，是指一种DNA分子，基因是遗传变异的主要物质，是控制生物性状的基本遗传单位，基因中编码RNA或蛋白质的碱基序列称为结构基因，本专利技术中所称的基因为结构基因。“载体”，是指能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子，一种类型的载体是“质粒”，质粒是其他的DNA片段可与其连接的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其可将其他的DNA片段连接至病毒基因组。某些载体整合至宿主细胞基因组中，并得以与宿主基因组一起复制。并且，某些载体能指导与其可操作连接的基因的表达，一般使用的这样的表达载体为质粒形式。“重组载体”，是指已连接了基因的表达载体。在本专利技术中，可交互使用“重组质粒”和“重组载体”。“引物”，又名引子。是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3’-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3’-OH必须是游离的。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。DNA上携带有编码蛋白质氨基酸信息的核苷酸序列的链称为正义链，又称编码链。另一条链核苷酸序列与正义链互补，称为反义链。一般将与正义链互补的一个引物称为上游引物，与反义链互补的一个引物称为下游引物。“纤维素酶”，纤维素酶是指能降解纤维素1，4-葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系。纤维素酶的主要组分是内切1，4-葡萄糖酶、外切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。前两种酶主要溶解纤维，后一种酶将纤维二糖转化为葡萄糖，适当调节组合物(即对组分酶系)中这三种主要成分活性的比例，实现完成纤维素的降解。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本专利技术所述的纤维二糖水解酶突变体T389K表达后凝胶电泳图；图2是本专利技术所述的纤维二糖水解酶突变体T389K提高水解率效果的曲线图；图3是本专利技术所述的纤维二糖水解酶突变体的水解率效果的曲线图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。本专利技术提供一种纤维二糖水解酶突变体，所述纤维二糖水解酶突变体的活性在纤维素降解中提供降解的功能，所述酶为如下(a)或(b)的蛋白质：(a)如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的第389位的苏氨酸被取代为其他氨基酸，所述其他氨基酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纤维二糖水解酶突变体，其特征在于，所述纤维二糖水解酶突变体的活性在纤维素降解中提供降解的功能，所述酶为如下(a)或(b)的蛋白质：(a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第389位的苏氨酸被取代为其他氨基酸，所述其他氨基酸为赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有纤维二糖水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
2017.10.26 CN 20171101970431.一种纤维二糖水解酶突变体，其特征在于，所述纤维二糖水解酶突变体的活性在纤维素降解中提供降解的功能，所述酶为如下(a)或(b)的蛋白质：(a)如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的第389位的苏氨酸被取代为其他氨基酸，所述其他氨基酸为赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有纤维二糖水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。2.一种组合物，其含有一种或几种酶，其特征在于，所述酶为权利要求1所述的纤维二糖水解酶突变体。3.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码如权利要求1或2所述的酶。4.如权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的碱基序列如SEQIDNO：4所示。5.一种重组载体，其特征在于，其含有权利要求3所述的DNA分子和与所述DNA分子可操作地连接的用于表达的调节序列。6.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的DNA分子或权利要求5所述的重组载体。7.一种获得如权利要求1所述的纤维二糖水解酶突变...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡文生，宗志友，邵学广，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12