一种用于防治金龟子的球孢白僵菌及其微生物菌剂制造技术

本发明专利技术公开了一种属于生物防治领域的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株JG‑17，其保藏编号为CGMCC No.14781。还公开了含有该菌株的微生物菌剂。该菌株对金龟子的杀虫活性高，防治效果好，而且杀虫谱广，同时对北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟和铜绿丽金龟3种金龟子种群、以及它们的成虫和幼虫有较高的杀虫活性，可广泛应用于花生、大豆、玉米、马铃薯等作物和草坪、果树等经济作物的金龟子的防治；另外，作为天然产物的JG‑17对环境友好、对人畜无毒；更可贵的是，本发明专利技术球孢白僵菌施用后能在感病金龟子虫体上进行自我繁殖，从而继续侵染下一代或其他金龟子种群，也进一步降低了成本。

A species of Beauveria bassiana and its microbial agent for the prevention and control of the beetle

The invention discloses a method belonging to the field of biological control of Beauveria bassiana strain JG (Beauveria bassiana) 17, the preservation number of CGMCC No.14781. Microbiological agents containing the strain were also disclosed. The insecticidal activity of the strain on the beetle, good control effect, and at the same time, wide pesticidal spectrum, Holotrichia, parallcl and Scarabaeoidae 3 beetle populations, and adults and larvae which have higher insecticidal activity, can be widely used to control peanut, soybean, corn, potato and other crops and the grass, fruit trees and other crops in the beetle; in addition, as a natural product of JG 17 environmentally friendly, non-toxic to humans and animals; furthermore, the invention of Beauveria bassiana after application can be self reproduction in susceptible beetles worms, which continue to infect the next generation or other beetle population also, to further reduce the cost.

【技术实现步骤摘要】
一种用于防治金龟子的球孢白僵菌及其微生物菌剂
本专利技术属于生物防治领域，具体地说涉及一种球孢白僵菌，还涉及利用该菌制备的微生物菌剂，以及它们在防治金龟子方面的用途。
技术介绍
金龟子是鞘翅目金龟子科昆虫的总称，全世界约有3万多种，我国约有1300种，其幼虫和成虫均可对作物和林木等造成危害。在我国为害作物的金龟子有100余种，其中华北大黑鳃金龟(HolotrichiaoblitaFaldermann)、暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)和铜绿丽金龟(AnomalacorpulentaMotschulsky)是危害最重、造成损失最大的三个种群。金龟子幼虫，俗称蛴螬，喜食作物的种子、根、块茎以及幼苗，造成缺苗、断垄，果实形成空壳或烂果，影响产品的品质和产量，严重时可造成作物绝收。金龟子成虫昼伏夜出，取食作物和林木的叶片，危害严重时常造成大片果树叶片残缺不全，甚至全树叶片被吃光。蛴螬具有生活环境隐蔽、适应性强的特点，是世界公认的难于防治的地下害虫之一。华北大黑鳃金龟(HolotrichiaoblitaFaldermann)幼虫主要为害草坪、阔(针)叶树根部及幼苗；其成虫取食杨、柳、榆、桑、核桃、苹果等多种果树和林木的叶片。暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)幼虫主要为害花生、豆类和薯类作物的地下部分，其成虫主要为害榆、柳、杨、核桃、桑、苹果、梨、向日葵和大豆等。铜绿丽金龟(AnomalacorpulentaMotschulsky)幼虫主要为害花生、大豆、玉米、棉花和果树等植物的根系，其成虫的寄主有苹果、山楂、海棠、梨、杏、桃、李、梅、柿和核桃等，以苹果属果树受害最重。防治金龟子的主要方法是化学防治，常用的化学药剂主要有吡虫啉、辛硫磷、毒死蜱和丁硫克百威等。化学药剂对金龟子有一定的防治效果，但化学农药的长期使用，加剧了害虫的抗药性的提高，产品农药残留越来越高，环境污染严重，另一方面化学农药容易杀伤天敌，破坏生态平衡。因此采用专化性强、害虫不易产生抗药性、且对天敌和环境友好的生物防治方法受到越来越多的关注。针对金龟子的生物防治主要是应用性诱剂、天敌和昆虫病原真菌，其中性诱剂可在田间诱捕金龟雄虫，同时干扰雌雄成虫交配，减少雌虫产卵，但性诱剂对幼虫没有作用，且诱芯稳定长效的问题有待解决。寄生性天敌如弧丽钩土蜂，对金龟幼虫有一定的专化性，但自然寄生率较低。在金龟科害虫生物防治中，已有利用白僵菌防治金龟子幼虫蛴螬的报道，如利用白僵菌防治花生田蛴螬(孙明海等，农药科学与管理，2009，30(12)：49-50)；用球孢白僵菌防治花生蛴螬，防效为67.2％～74.0％(陈正州等，现代农业科技，2011，4:144-146)；用球孢白僵菌防治甘蔗田蛴螬，防治效果为54.29％(俞德洪，现代农业科技，2016，6:131-132)；用白僵菌防治甘蔗田蛴螬和金龟子(CN103461387A)。但是上述白僵菌防治金龟科害虫多局限于金龟子的幼虫，且已有的白僵菌对金龟子幼虫均具有较明显的专化性，即一种白僵菌只对某一种金龟子幼虫有相对较好的防治效果；另外，上述白僵菌对金龟子的防治效果还不十分理想，因此在实际应用中经常和化学药剂混合应用。经检索，未发现同时对多种金龟子种群，并且同时对金龟子成虫和幼虫具有较高杀虫活性的白僵菌的报道。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种球孢白僵菌菌株，该菌株对金龟子杀虫活性高，防治效果好，并且杀虫谱广，对华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟和铜绿丽金龟幼虫和成虫均具有高毒杀能力，而且不存在环境污染和产生抗药性问题。本专利技术另一目的在于提供一种微生物菌剂。本专利技术第三目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。本专利技术第四目的在于提供上述球孢白僵菌在防治金龟子上的用途。本专利技术第五目的在于提供上述微生物菌剂在防治金龟子上的用途。本专利技术第六目的在于提供用于鉴定上述球孢白僵菌的分子标记。本专利技术第七目的在于提供利用上述球孢白僵菌防治金龟子的方法。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下:本专利技术提供了一种球孢白僵菌(Beauveriabassiana)菌株JG-17，其保藏编号为CGMCCNo.14781。本专利技术还提供了一种微生物菌剂，所述的微生物菌剂的活性成分为上述球孢白僵菌(Beauveriabassiana)菌株JG-17的分生孢子。上述微生物菌剂，其剂型为液体制剂或固体制剂等。上述微生物菌剂，其液体制剂为孢悬液等本专利技术还提供了上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：(1)菌种活化：将低温保存的球孢白僵菌菌株JG-17在PDA平板培养基上活化，挑取单菌落接种在PDA平板培养基上，在25～28℃培养5～7天，得活化菌株；(2)种子液制备：用无菌接种环挑取一环步骤(1)活化的菌株接种到100mLPDB液体培养基中，在25～28℃、转速为180～220rpm的摇床上培养17～24小时，得种子液；(3)固体发酵培养：按照液固比(V/W)5～10％的比例将步骤(2)中的种子液接入到袋装灭菌的玉米固体培养基(自然pH值)中，搅拌均匀，在25～28℃条件下发酵培养5～7天，得固体发酵料；(4)将步骤(3)所得的固体发酵料倒入托盘中，在干燥通风处晾干，待发酵料含水量低于5％时，通过分孢器分离获得分生孢子粉；再用体积百分比为0.02％(v/v)的吐温-80水溶液稀释分生孢子粉，得液体制剂。上述制备方法步骤(1)中所述的PDA平板培养基的组成成分及其重量比为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1L，自然pH。上述制备方法步骤(2)中所述的PDB液体培养基的组成成分及其重量比为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1L，自然pH。所述的PDA平板培养基和PDB液体培养基均按照常规方法制备。上述制备方法步骤(3)中所述的玉米固体培养基的的组成成分及其比例为：粒径大小2～4mm的玉米碎颗粒，颗粒大小混杂即可，其余成分重量百分比为：色拉油0.2～0.5％，无机盐水溶液0.2％；所述无机盐水溶液的组成成分及重量百分比为0.05％KH2PO4、0.01％MgSO4、0.2％NH4NO3，其余为水。上述制备方法，将步骤(3)中所得的固体发酵料进行二次粉碎，得固体制剂。玉米固体培养基制备方法及其JG-17固体培养方法如下：将粉碎机粉碎得到的大小不规则的玉米碎颗粒在常温水中浸泡3～4小时，使玉米碎颗粒平均含水量达到25％左右，然后将玉米碎颗粒捞出并控去多于水分，添加色拉油防止灭菌过程中玉米颗粒黏成团，同时添加无机盐溶液，充分混合均匀后，将培养基置于聚丙烯PP塑料袋内，每袋装400g湿料，用聚丙烯PP管扎口，管口依次用三层棉布和封口膜封口，121℃高温蒸汽灭菌40min。灭菌完成待培养基冷却后，接种球孢白僵菌JG-17种子液，混合均匀后在25～28℃下进行培养。上述微生物菌剂，其含有的球孢白僵菌JG-17菌株的分生孢子数大于50×108个孢子/g固体制剂，或1×108个孢子/mL液体制剂(或称：孢悬液)。上述球孢白僵菌(Beauveriabassiana)JG-17在防治金龟子成虫或幼虫上的应用上述微生物菌剂在防治金龟子成虫或幼虫上的应用。上述应用中所述的金龟子是指华北大黑鳃金龟(HolotrichiaoblitaFal本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株JG‑17，其保藏编号为CGMCC No.14781。

【技术特征摘要】
1.一种球孢白僵菌(Beauveriabassiana)菌株JG-17，其保藏编号为CGMCCNo.14781。2.一种微生物菌剂，其特征在于所述的微生物菌剂的活性成分为权利要求1所述的球孢白僵菌(Beauveriabassiana)菌株JG-17的分生孢子。3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于其剂型为液体制剂或固体制剂。4.权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)菌种活化：将低温保存的球孢白僵菌菌株JG-17在PDA平板培养基上活化，挑取单菌落接种在PDA平板培养基上，在25～28℃培养5～7天，得活化菌株；(2)种子液制备：用无菌接种环挑取一环步骤(1)活化的菌株接种到100mLPDB液体培养基中，在25～28℃、转速为180～220rpm的摇床上培养17～24小时，得种子液；(3)固体发酵培养：按照液固比(V/W)5～10％的比例将步骤(2)中的种子液接入到袋装灭菌的玉米固体培养基(自然pH值)中，搅拌均匀，在25～28℃条件下发酵培养5～7天，得固体发酵料；(4)将步骤(3)所得的固体发酵料倒入托盘中，在干燥通风处晾干，待发酵料含水量低于5％时，通过分孢器分离获得分生孢子粉；再用体积百分比为0.02％(v/v)的吐温-80水溶液稀释分生孢子粉，得液体制剂。5.根据权利要求4所述的制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹伟平，杜立新，宋健，冯书亮，
申请(专利权)人：河北省农林科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：河北,13