鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因制造技术

本发明专利技术涉及到具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽、编码该多肽的核酸、含有该核酸的重组ＤＮＡ、带有该核酸或该重组ＤＮＡ的导入细胞用载体、带有该核酸或该重组ＤＮＡ的转化体的该多肽的制造方法，针对该核酸的寡核苷酸探针或引物、使用该探针或引物的该核酸的检测方法及其试剂盒、针对该多肽的抗体或其片段、使用该抗体或其片段的该多肽的检测方法及其试剂盒。本发明专利技术可用于鞘脂工程、神经系统疾病（例如神经变性疾病）、白血病、创伤等疾病的治疗。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及到具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽、编码该多肽的核酸以及利用他们的技术。更详细地讲，本专利技术涉及到作为用于解析鞘脂结构和功能的鞘脂工程用试剂有用的具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶的氨基酸序列的多肽；具有编码该多肽的碱基序列的核酸；具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的基因工程制造方法；该多肽的检测方法及其试剂盒，和编码该多肽的基因的检测方法及其试剂盒。
技术介绍
近年来，作为真核生物的细胞膜脂质的构成成分，甘油脂以及鞘脂具有的各种各样的生理功能受到人们的注目。作用于该鞘脂，生成脂肪酸和溶血鞘脂的鞘脂神经酰胺脱酰基酶(SCDase)不仅在阐明鞘脂的生理作用上有用，而且在称之为鞘脂衍生物的制作和标记的鞘脂工程领域中是非常重要的酶。以前作为作用于神经酰胺水解鞘氨醇碱基和脂肪酸之间酰胺键的酶已知有神经酰胺酶(CeramidaseEC3.5.1.23)。但是这样的酶不能水解鞘糖脂或鞘磷脂中神经酰胺部分的鞘氨醇碱基和脂肪酸之间的酰胺键。而由属于诺卡氏菌(Nocardia)属、红球菌(Rhodococcus)属、链霉菌(Streptomyces)属微生物生产的酶作用于鞘糖脂可以水解鞘氨醇碱基和脂肪酸之间的酰胺键，生成溶血鞘糖脂(lysosphingoglycolipid)和脂肪酸。但无论哪一种酶都具有底物特异性窄，不能作用于所有鞘脂的性质。就是说，由属于诺卡氏菌属的微生物生产的酶虽然可作用于GD1a、GM1、GM2、GM3等所谓的酸性糖脂，但却几乎完全不能作用于中性糖脂。相反，由属于红球菌属微生物生产的酶可作用于中性糖脂，但却不能作用于酸性糖脂。而由属于链霉菌属微生物生产的酶不能作用于GM3和作为中性糖脂的乳糖苷神经酰胺、脑苷脂类等。另外无论上述的哪一种酶都不能作用于鞘磷脂。与上述酶不同，来自嗜糖假单胞菌TK-4(Pseudomonassp.TK-4)菌株的SCDase对包括酸性糖脂、中性糖脂以及鞘磷脂在内的所有鞘脂具有广泛的底物特异性。而该SCDase不仅催化鞘脂生成对应的溶血鞘脂和脂肪酸的水解反应，而且也催化由溶血鞘脂和脂肪酸合成鞘脂的缩合反应，还催化将鞘脂的脂肪酸部分换成其他脂肪酸的交换反应(国际公开第98/03529号小册子)。因此该酶是鞘脂工程领域中的非常重要的工具，产业上利用价值高。然而，想要在工业上由微生物有利地制造上述的SCDase时，为了诱导天然存在的该酶的生成，在培养时必须要向培养基中添加神经节苷脂混合物。由于在培养液中有时生成游离的脂肪酸和溶血鞘糖脂，以及鞘磷脂酶等目的以外的酶也同时生成，要将这些脂和混杂的酶与目的SCDase进行分离纯化是困难的。于是为了通过基因工程方法制造嗜糖假单胞菌TK-4生产的SCDase，克隆了该SCDase基因，制作了导入了该基因的转化体(特开平11-276177号公报)。但是转化体中生产的SCDase或者是活性低，或者是不能检测的水平，所以通过基因工程方法制造SCDase是困难的。本专利技术的目的在于提供在鞘脂工程领域有用的具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽、编码该多肽的核酸；容易且可大量制造该多肽的基因工程制造方法；能与该核酸特异杂交的寡核苷酸探针或引物、使用该寡核苷酸探针或引物的鞘脂神经酰胺脱酰基酶基因的检测方法、以及检测用的试剂盒、能与本专利技术的多肽特异结合的抗体或其片段、使用该抗体或其片段的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的检测方法及使用其的试剂盒。附图的简单说明附图说明图1为质粒pSCD1插入DNA片段的限制酶酶切图谱。专利技术公开本专利技术人为了分离编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的基因进行了锐意研究，结果在具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的基因的分离和其碱基序列的解析中获得了成功，而且在此基础上确立了容易且可大量制造高纯度的鞘脂神经酰胺脱酰基酶的方法，具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的检测方法以及该基因的检测方法，直至本专利技术的完成。即，本专利技术的要点如下从下述(a)～(c)选择出的多肽，而且是具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽(a)具有序列20所示氨基酸序列或其一部分序列的多肽；(b)由具有在序列20所示氨基酸序列中至少缺失、附加、插入或置换一个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽；以及(c)与序列20所示氨基酸序列至少有25％序列同一性的多肽；从下述(A)～(H)中选择出的核酸，而且是编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的核酸；(A)编码具有序列20所示氨基酸序列或其一部分序列的多肽的核酸；(B)编码由具有在序列20所示氨基酸序列中至少缺失、附加、插入或置换一个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽的核酸；(C)编码与序列20所示氨基酸序列至少有25％序列同一性的多肽的核酸；(D)具有序列19所示碱基序列或其一部分序列的核酸；(E)具有在序列19所示碱基序列中至少缺失、附加、插入或置换一个碱基的碱基序列的核酸；(F)在能与上述(A)～(F)任一项记载的核酸或其互补链杂交的核酸；(G)具有由于密码子简并而与上述(A)～(F)任一项记载的核酸不同的碱基序列的核酸；以及(H)具有与上述(A)～(G)任一项记载的核酸的碱基序列至少有17％序列同一性的碱基序列的核酸；含有上述记载的核酸的重组DNA，带有上述记载的核酸或上述记载的重组DNA的转化体，具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的制造方法，其特征是在适于鞘脂神经酰胺脱酰基酶表达的条件下对上述的转化体进行培养，然后从得到的培养物中提取具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽，可在严格条件下能与上述记载的核酸杂交的寡核苷酸探针或引物，至少由连续15个核苷酸构成的上述记载的寡核苷酸探针或引物，编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的核酸的检测方法，其特征是使含有核酸的被检测样品与上述或记载的寡核苷酸探针接触，然后对核酸与寡核苷酸探针的杂化体进行检测。编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的核酸的检测方法，其特征是以含有核酸的被检测样品作为模板样品，使用上述或记载的引物进行核酸扩增。包含上述或记载的寡核苷酸探针和/或引物在内的用于检测编码具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的核酸的试剂盒，可以特异地与上述记载的多肽结合的抗体或其片段，具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的检测方法，其特征是使含有多肽的被检测样品与上述记载的抗体或其片段接触，对多肽与抗体或其片段的复合物进行检测，以及包含上述记载的抗体或其片段、用于检测具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽的试剂盒。在本专利技术说明书中，所谓“鞘脂神经酰胺脱酰基酶”就像上述那样是具有作用于鞘脂，使其水解为鞘氨醇类碱和脂肪酸的活性，但对神经酰胺几乎或完全没有作用的酶。另外在本说明书中，有时将“具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽”记载为“鞘脂神经酰胺脱酰基酶”。本专利技术的鞘脂神经酰胺脱酰基酶由于具有很宽的底物特异性，可用于对细胞工程中糖脂的生物功能进行解析的方法、有用的鞘脂的大量生产、鞘脂的功能变换、鞘脂的探针的制作、新的鞘脂的创制等鞘脂工程中。另外可以应用于神经系统疾病(例如神经变性疾病等)、白血病、创伤等疾病的治疗中。鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性也可以按照诸如Journal ofBiological Chemistry、第270卷、第24370-24374页(1995)记载的方法进行测定。具体来说，如本文档来自技高网...

【技术保护点】
从下述（ａ）～（ｃ）选择出的多肽，而且是具有鞘脂神经酰胺脱酰基酶活性的多肽：（ａ）具有序列２０所示氨基酸序列或其一部分序列的多肽；（ｂ）由具有在序列２０所示氨基酸序列中至少缺失、附加、插入或转换一个氨基酸的氨基酸序列构成的多 肽；以及（ｃ）与序列２０所示氨基酸序列至少有２５％序列同一性的多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊东信，古里正子，末吉纪行，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]