琼脂糖酶及其基因制造技术

本发明专利技术涉及可用于有效地生产琼脂寡糖、从琼脂糖凝胶中有效地提取核酸等物质的、具有琼脂糖酶活性的多肽、所述多肽的氨基酸序列、编码所述多肽的基因、所述多肽的生产方法以及琼脂寡糖的生产方法和从琼脂糖凝胶提取核酸等物质的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在高温下具有琼脂糖酶活性的新型琼脂糖酶及其生产方法和应用。本专利技术也涉及在高温下具有琼脂糖酶活性的多肽和编码所述多肽的基因。此外，本专利技术涉及利用所述基因通过基因工程生产在高温下具有琼脂糖酶活性的多肽的方法。具体地说，本专利技术涉及可用于从琼脂糖生产具有各种生理活性的低聚合度琼脂寡糖、在高温下具有琼脂糖酶活性的α-琼脂糖酶、以及所述酶的生产方法和应用。本专利技术也涉及在高温下具有可用于在琼脂糖凝胶电泳之后从琼脂糖凝胶提取核酸等的活性的β-琼脂糖酶及其生产方法、所述酶的应用以及用所述酶从琼脂糖凝胶提取核酸等的方法。
技术介绍
琼脂糖是琼脂的主要组分。琼脂糖是一种其结构为D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖通过α-1，3键和β-1，4键交替连接在一起的多糖。为了从琼脂生产寡糖，人们必须将琼脂糖降解为更小的分子。为此，传统上已知化学降解琼脂糖的方法和酶促消化琼脂糖的方法。在化学降解法中，可以用酸水解琼脂糖。在这种情况下，主要切割α-1，3键。已知有两种类型的酶消化琼脂糖，即切割琼脂糖中β-1，4键的β-琼脂糖酶和切割琼脂糖中α-1，3键的α-琼脂糖酶。通过在β-1，4键切割琼脂糖获得的寡糖称为新琼脂寡糖。新琼脂寡糖在其还原末端具有D-半乳糖，其聚合度以平均数表示。另一方面，通过在α-1，3键切割琼脂糖获得的寡糖称为琼脂寡糖。琼脂寡糖在其还原末端具有3，6-脱水-L-半乳糖，其聚合度以平均数表示。最近，已表明在其还原末端具有3，6-脱水-L-半乳糖的琼脂寡糖具有诸如以下的生理活性细胞凋亡诱导活性、制癌活性、各种抗氧化活性、免疫调节活性、抗变态反应活性、抗炎活性和抑制α-糖苷酶的活性(WO99/24447，日本专利申请11-11646号)。基于生理活性，可以提供含有所述琼脂寡糖作为其有效成分的药用组合物和功能食品或饮料。在化学降解琼脂糖的方法中控制所生产的寡糖的大小是困难的。具体地说，选择性生产具有低聚合度的较小的寡糖相当困难(例如T.Tokunaga等，Bioscience & Industry，49734(1991))。如果使用β-琼脂糖酶，由于这种酶仅切割β-1，4键，所以仅可以获得不具有上述生理活性的新琼脂寡糖。预期使用具有切割α-1，3键的活性的α-琼脂糖酶，生产具有生理活性的琼脂寡糖。已知的α-琼脂糖酶包括由海洋革兰氏阴性菌菌株GJ1B产生的酶(Carbohydrate Research，66207-212(1978)；在EuropeanJournal of Biochemistry，214599-607(1993)中提出该菌株为解琼脂交替单胞菌(Alteromonas agarlyticus)GJ1B)，以及由弧菌属(Vibrio)细菌生产的酶(JP-A 7-322878；菌株JT0107-L4)。然而，利用解琼脂交替单胞菌GJ1B来源的α-琼脂糖酶，不可能生产具有重要的生理活性琼脂二糖，因为这种酶不能消化己糖或更短的寡糖。此外，所述弧菌属细菌来源的α-琼脂糖酶不能用来用琼脂糖作为原料生产琼脂寡糖，因为该酶仅对己糖和更短的寡糖表现出其活性，而对琼脂糖根本不起作用。本专利技术人进行深入的研究，以便获得切割琼脂糖中α-1，3键并且产生具有重要生理活性的琼脂寡糖的酶，发现了产生具有适合于此目的的特性的酶的两种微生物。分离由这些微生物产生的酶，并且指明其理化特性以及酶特性。此外，本专利技术人还分离出所述两种酶的基因，发现了用所述基因(WO 00/50578)通过基因工程便捷地生产具有α-琼脂糖酶活性的多肽的方法。如果人们想通过用所述两种α-琼脂糖酶之一处理溶解的琼脂糖而获得琼脂寡糖，则反应温度需要低于约40℃，因为所述酶的最适反应温度约为40℃。在这种情况下，如果琼脂糖浓度高，则琼脂糖可能固化，可能妨碍所述酶促反应。因此，如果使用这样一种酶，则需要用低浓度的琼脂糖进行所述处理。因而不能处理高浓度的琼脂糖，琼脂寡糖的生产率低。因此，需要在即使琼脂糖以高浓度溶解时琼脂糖也不会固化的高温下具有活性的热稳定α-琼脂糖酶。另一方面，在基因工程领域广泛进行在琼脂糖凝胶电泳之后从琼脂糖中提取已经过限制性酶处理或者扩增反应的核酸等。对于所述程序，常规上使用最适温度约37℃的β-琼脂糖酶。又是在这种情况下，根据所述酶的最适温度，需要降低反应温度，并且必须通过将含有待处理核酸等的琼脂糖凝胶溶于大体积的水中降低琼脂糖浓度，以防止琼脂糖固化。这样，待回收的核酸等的浓度也不可避免地被降低。浓度的降低产生问题，因为这导致回收率降低、琼脂糖消化效率降低和程序延长。为了解决这些问题，可以在高于常规温度的温度下进行反应所用的琼脂糖酶是必不可少的。美国专利第5,869,310号中描述的黄杆菌(Flavobacterium sp.)菌株NR19来源的β-琼脂糖酶可以被认为是这样一种琼脂糖酶，虽然其最适温度并不是如此高，并且热稳定性不足。因此，需要在高浓度的琼脂糖不会固化的高温下具有活性的热稳定β-琼脂糖酶。如上所述，现有技术在琼脂寡糖生产和从琼脂糖凝胶提取诸如核酸的物质方面存在问题。专利技术目的本专利技术的主要目的是提供具有琼脂糖酶活性、可以用于有效生产琼脂寡糖、从琼脂糖凝胶有效提取诸如核酸的物质等的多肽；所述多肽的氨基酸序列；编码所述多肽的基因；生产所述多肽的方法；生产琼脂寡糖的方法以及从琼脂糖凝胶提取诸如核酸的物质的方法。专利技术概述鉴于上述问题，本专利技术人已经进行了深入的研究和探索，以便获得在高温下切割琼脂糖中α-1，3键并且可用于生产具有重要生理活性的琼脂寡糖的酶、以及在高温下切割琼脂糖中β-1，4键并且可用于从琼脂糖凝胶有效提取核酸等的酶。结果，本专利技术人成功地发现了产生具有适合于所述相应目的的特性的两种酶的微生物。从所述微生物中分离出所述酶，并且指出其理化特性和酶特性。此外，本专利技术人成功地分离出编码所述酶的基因，并且发现了用所述基因通过基因工程便捷地生产本专利技术的具有α-琼脂糖酶活性的多肽和具有β-琼脂糖酶活性的多肽的方法。因而完成了本专利技术。本专利技术概述如下。本专利技术的第一方面涉及新型琼脂糖酶，所述琼脂糖酶含有选自以下的氨基酸序列或者在所述氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列(1)由SEQ ID NO22的氨基酸序列中第21号氨基酸至第437号氨基酸的417个残基组成的氨基酸序列；或者(2)由SEQ ID NO23的氨基酸序列中第318号氨基酸至第1089号氨基酸的772个残基组成的氨基酸序列。所述琼脂糖酶的示例为具有水解D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖之间的β-1，4键的活性的酶、或者具有水解3，6-脱水-L-半乳糖和D-半乳糖之间的α-1，3键的活性的酶。本专利技术的第二方面涉及编码具有琼脂糖酶活性的多肽的基因。所述基因编码第一方面的琼脂糖酶。所述基因的示例为含有由SEQ IDNO20的核苷酸序列中第61号核苷酸至第1311号核苷酸的1251个核苷酸组成的核苷酸序列或者在所述由1251个核苷酸组成的核苷酸序列中一个或多个核苷酸被取代、缺失、添加和/或插入的核苷酸序列的基因、或者含有由SEQ ID NO21的核苷酸序列中第952号核苷酸至第3267号核苷酸的2316个核苷酸组成的核苷酸序列或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种琼脂糖酶，所述琼脂糖酶含有由ＳＥＱＩＤＮＯ：２２的氨基酸序列中第２１号氨基酸至第４３７号氨基酸的４１７个残基组成的氨基酸序列或者在所述氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和／或插入的氨基酸序列，并且具有水解Ｄ－半乳糖和 ３，６－脱水－Ｌ－半乳糖之间的β－１，４键的活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：友野润，佐川裕章，加藤郁之进，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]