L-氨基酸的生产方法技术

通过在培养基中培养具有生产Ｌ－氨基酸能力的细菌，以使Ｌ－氨基酸在培养基中积累，从培养物中收集Ｌ－氨基酸，来生产Ｌ－氨基酸，所述细菌被修饰，从而增强其细胞内合成ｐｐＧｐｐ的能力。

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
专利
本专利技术涉及发酵工业。更特别的是，本专利技术涉及一种具有生产L-氨基酸能力的细菌，以及使用该菌生产L-氨基酸的方法。相关技术的描述目前，广泛认为ppGpp(鸟苷-3’-二磷酸-5’-二磷酸)和pppGpp(鸟苷-3’-三磷酸-5’-二磷酸)在微生物细胞中作为信号物质发挥着重要的作用。已知ppGpp是一种基本的物质，当微生物增殖所必须的细胞内氨基酸和糖都被耗尽时，该物质能够诱导微生物体内的适应机制，从而使其在此条件下得以存活。据报道，ppGpp分别由RelA蛋白和SpoT蛋白产生，两者又分别是大肠杆菌体内的relA基因和spoT基因的编码产物。此外，这些基因和蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列也都被报道过(GenBank accession J04039，Metzger，S.et al.，J.Biol.Chem.，1988，263(30)，15699-15704，GenBank accession AE000442U00096)。RelA蛋白在细菌细胞中以与核糖体结合的形式存在，当它接受氨基酸损耗(depletion)的信号时，就将一个非氨酰化的tRNA结合到核糖体上，然后利用GTP和GDP来生产pppGpp。另一方面，已知SpoT蛋白是一种酶，该酶能够催化三种反应，如从pppGpp到ppGpp的反应，从GTP到ppGpp的反应和从ppGpp到GTP的反应。在下文中ppGpp和pppGpp均称为是“ppGpp”，因为它们被认为在细胞中的生理学功能上是相同的。已知当培养基内和细胞中的氨基酸突然损耗时，ppGpp就会通过RelA蛋白在细胞内积累，这些细胞通常表现出一系列的反应，包括核糖体合成的终止，核糖体蛋白的降解，不同氨基酸生物合成途径中的基因表达的增强等等。这些通常被认为是应急反应(stringent responses)，并且这些应急反应已被广泛认为对于细胞在由于氨基酸耗尽而导致的饥饿状态下的存活是必要的反应(Cashel，M，Gentry，D.R.，Hernadez，V J.，and Vinella，D.，The stringent response，InNeidhardt，F.C.et al.(ed)Escherichia coli and Salmonella；Cellar and Molecular Biology，2ndedition，1458-1469(ASM Press，Washington d.c.，1996)。到目前为止，分析实例将注意力放在ppGpp引起的物质的产生上，包括使用消除了产生ppGpp活性的重组大肠杆菌以提高蛋白的产量(Dedhia，N.et al.，Biotechnol.Bioeng.，1997，Vol.53，379-386)，通过修饰放线菌体内的核糖体蛋白和RNA聚合酶的ppGpp-结合位点来提高抗生素的生产能力(Hu，H.，and Ochi，K.，Appl.Environ.Microbiol.，2001，Vol.67，1885-18921，Hu，H.，Zhang，Q.，and Ochi，K.，J.Bacteriol.，2002，Vol.184，3984-3991)等等。然而，至今仍没有有关氨基酸生物合成系统与ppGpp生产能力之间关系的研究报道，其中所述生物合成系统被公认为由ppGpp直接作用。专利技术概述本专利技术的一个目的是提高细菌生产L-氨基酸的能力，以及具有生产L-氨基酸能力被提高的细菌。本专利技术的一个目的是提供一种生产L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基上培养具有生产L-氨基酸能力的细菌，使L-氨基酸在培养物中积累，然后从培养物中收集L-氨基酸，其中所述的细菌被修饰过，从而使提高了合成ppGpp的活性。本专利技术的进一步的目的是提供上面所述的方法，其中所述的细菌经过修饰从而合成ppGpp的酶的活性被提高了。本专利技术的进一步的目的是提供上面所述的方法，其中所述的酶是RelA蛋白，或者是该蛋白的催化结构域。本专利技术的进一步的目的是提供上面所述的方法，其中所述的RelA蛋白的活性通过提高relA基因的拷贝数或者是提高编码RelA蛋白催化结构域的relA基因的部分区域的拷贝数而被增强；或者通过修饰relA基因的表达调控序列，从而使细菌细胞内relA基因的表达或编码RelA蛋白催化结构域的relA基因的部分区域的表达得以增强。进一步目的是提供上面所述的方法，其中所述的RelA蛋白被定义为如下的(A)或(B)(A) 一种具有SEQ ID NO20所示氨基酸序列的蛋白。(B) 一种具有SEQ ID NO20的包括其替换，缺失，插入，增加一个或几个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白，且所述的蛋白具有合成ppGpp的活性。并且所述蛋白质具有合成ppGpp的活性。本专利技术的进一步的目的是提供一种上述的方法，其中所述的RelA蛋白是由如下(a)或(b)编码的(a)具有SEQ ID NO19所示核苷酸序列的DNA。(b)具有在严谨条件下能与SEQ ID NO.19核苷酸序列杂交的DNA，且所述的DNA编码具有合成ppGpp活性的蛋白。本专利技术的进一步的目的是提供一种上面所述的方法，其中所述的L-氨基酸选自L-谷氨酸，L-苏氨酸，L-异亮氨酸，L-赖氨酸，L-组氨酸，L-缬氨酸，L-精氨酸，L-亮氨酸，L-苯丙氨酸和L-色氨酸。本专利技术的进一步的目的是提供一种上面所述的方法，其中所述的L-氨基酸选自L-谷氨酸，L-苏氨酸，L-异亮氨酸和L-赖氨酸。本专利技术的进一步的目的是提供一种上面所述的方法，其中所述的细菌属于埃希氏菌属。本专利技术的更进一步的目的是提供一种具有生产L-氨基酸能力的和经过修饰，并增强细胞内RelA蛋白的活性的细菌。根据本专利技术，细菌生产L-氨基酸的能力能被提高。附图简要说明附图说明图1显示质粒pM14和pM15的构建。图2显示质粒pMD4041-cat-2Tfd的构建。图3显示质粒pSTVrelA和pSTVrelA*的构建。优选实施例的描述本专利技术的专利技术人为了实现前述专利技术目的，进行了刻苦的研究。结果发现通过提高ppGpp的生产能力，特别是通过增强RelA蛋白合成ppGpp的活性，能够提高L-氨基酸的生产能力。因此，完成本专利技术。接下来，对本专利技术进行详细描述。本专利技术中所使用的细菌本专利技术中的细菌具有生产L-氨基酸的能力，并且经过修饰使其在细胞内合成ppGpp的能力增强。本专利技术中的细菌没有特别的限制，只要通过增强细胞内合成ppGpp的活性，其生产L-氨基酸的能力可被增强。细菌的实例，包括但不局限于，属于埃希氏菌属(Escherichia)的细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)，棒状杆菌如乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)，属于沙雷氏菌属(Serratia)的细菌如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，属于杆状菌属(Bacillus)的细菌如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等等。本专利技术中所使用的术语“生产L-氨基酸的能力”是指，当本专利技术的细菌在培养基中培养时，能够促使L-氨基酸在培养基中积累的一种能力。这种生产L-氨基酸的能力可以是野生型细菌菌株内在固有的一种性质，也可以是通过繁殖(breedin本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产Ｌ－氨基酸的方法，其包括：ａ）在培养基中培养具有生产Ｌ－氨基酸能力的细菌，以使Ｌ－氨基酸在培养物中积累，和ｂ）从培养物中收集Ｌ－氨基酸，其中所述的细菌被修饰过，从而提高了合成ｐｐＧｐｐ的活性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：今泉明，RS沙库罗夫，AL布芮克哈诺夫，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]