水解氮源制造技术

本发明专利技术涉及一种以工业规模生产目的酶的方法，包括：ａ）用含有一或多种部分预水解复合氮源的发酵培养基通过微生物发酵的方式生产所需要的酶，这些部分预水解复合氮源与其他含有碳水化合物的其他营养源分开灭菌，所述预水解通过加入酸和／或水解酶完成；和ｂ）从发酵培养液回收酶。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

此项专利技术是通过向发酵培养基中加入一种或几种部分预水解复合氮源的方法，以更经济的方式发酵生产所需酶。
技术介绍
用于工业化发酵生产有用化合物的培养基，其中通常含有如大豆、玉米浆、酵母提取物等传统氮源。但使用这些传统氮源有许多缺点，如在加热灭菌时粘度高、原材料改变、酶难于复性回收、产生有色副产物等。而且这些传统氮源的成本昂贵，或消耗得过快。可以最低培养基代替传统氮源，例如WO 98/37179中所述方法就是一例，但这一方法的缺点是菌体生长缓慢且酶产量低。而在WO 01/05997中描述了用含有水解大豆蛋白的培养基生产破伤风毒素，专利技术者在67页中所述，将葡萄糖与剩余的培养基一起高压灭菌将有利于菌体的生长和毒素的产生。专利技术概要专利技术者发现，为了确保氨基酸/肽利于微生物菌株的快速生长和/或保证所需产物的高产量，就需要在发酵培养基中加入部分预水解的复合氮源，所以我们希望保护一种工业化生产酶的方法，包括a)利用微生物发酵生产相关酶时，发酵培养基中含有一种或几种预水解的复合氮源，其中这些部分预水解的氮源应该与任何其它碳水化合物源分开灭菌，复合氮源的预水解可通过向其加入酸和/或水解酶的方式来达到。以及 b)从发酵培养基中回收所需酶。专利技术详述微生物菌种此专利技术中所用的微生物菌种可以是任何种属的微生物。优选可以用细菌或真菌来生产相关酶。例如，可以用某些革兰氏阳性菌，如芽孢杆菌，如嗜碱芽胞杆菌、如解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽胞杆菌、凝结芽胞杆菌、缓慢芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌；或链霉菌属，如浅青紫链霉菌、鼠灰链霉菌等；此外也可利用诸如大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌。同样也可以通过真菌获得相关酶，如假丝酵母属、卡氏酵母(Kluyveromyces)属、毕赤酵母属、糖酵母属、裂殖酵母属、Yarrowia属，例如卡尔酵母、啤酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克鲁维氏酵母、诺地酵母或Saccharomyces oviformis等利用一些丝状真菌也可以产生所需要的酶。这些丝状真菌包括顶孢霉属(Acremonium)，曲霉菌属，桃木属(Aureobasidium)，隐球菌属，镰刀菌属，腐质霉属，Magnaporthe，毛霉菌属，毁丝霉属，Neocallimastix，脉孢菌属，拟青霉菌属，青霉菌属，瘤胃真菌属(Piromyces)，裂褶菌属，Talaromyce嗜热子囊菌属，梭孢壳属，Tolypocladium属，木霉属等，具体地，酶可得自棘孢曲霉，泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉，构巢曲霉，黑曲霉，米曲霉，黍镰刀菌，黄色镰刀菌，禾谷镰刀菌，穗枯镰刀菌，尖孢镰刀菌，粉红镰刀菌，接骨木镰刀菌，硫色镰刀菌，香蕉镰刀菌，镰孢菌，脉孢菌，米赫根毛霉、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌、产紫青霉菌，木素木霉菌，康宁木霉菌，长枝木霉菌，里氏木霉菌，绿色木霉菌等。以上所涉及的所有菌种都可以在公共的微生物收集中心获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物和细胞培植中心(DSM)、荷兰真菌酵母收集中心(CBS)和农业研究服务培育和收集中心，美国农业研究菌种保藏中心北部地区研究服务中心(NRRL)。总之，为了应用此专利技术生产所需的酶，在这里所用的术语“从……获取”是与所给源相关联的，这就表示相关酶是插入了源的基因的细胞所产生的。相关酶相关的酶可能是某个肽段或某种酶。对本文来说首选含有5到100个氨基酸的肽段(peptide)；含有10到80个氨基酸、15到60个氨基酸、15到40个氨基酸的肽段则依次更佳。具体来说，这种方法需要应用到酶，特别是水解酶(酶命名法即EC3类；根据国际生物化学联盟命名委员会推荐)。更为具体的说推荐以下水解酶蛋白酶适合的蛋白酶来源于包括动物、植物或者微生物。微生物来源的蛋白酶更佳，包括经化学修饰过或经蛋白工程突变的蛋白酶。蛋白酶可以是酸性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或金属酶，最好是微生物来源的碱性蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶(类胰蛋白酶trypsin-like protease)。蛋白酶和肽酶分别根据在细胞中的酶活性＞＝或＜10％被定义为自我破坏性和非破坏性，细胞培养在无细胞肉汤培养物中，培养时间为24小时，发酵过程中无细胞肉汤培养物酸碱度和温度值的选择按照一定数值，这些值是发酵过程中从收获前24小时到收获时有代表性的酸碱度和温度范围。无细胞肉汤培养物由肉汤经过过滤、离心或类似程序分离而由肉汤溶液中的非溶质(包括细胞)得到。碱性蛋白酶的例子是枯草杆菌蛋白酶，特别是那些起源于芽孢杆状菌的酶，例如枯草杆菌蛋白酶Novo，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(在WO 89/06279中述及)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子有胰蛋白酶(例如猪或牛起源的)和镰刀霉蛋白酶，在WO 89/06270和WO 94/25583中述及。可用的蛋白酶的例子是WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中述及的变体，尤其是替换了以下一个或多个位点的27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。可用的较好的商品蛋白酶包括ALCALASETM、SAVINASETM、PRIMASETM、DURALASETM、ESPERASETM、RELASETM和KANNASETM(诺维信A/S)，MAXATASETM、MAXACALTM、MAXAPEMTM、PROPERASETM、PURAFECTTM、PURAFECTOXPTM、FN2TM和FN3TM(Genencor国际公司)。肽酶适合的肽酶例如FLAVOURZYMETM(诺维信A/S)。脂肪酶脂肪酶包括来源于细菌或真菌，亦包括来源于经化学修饰的突变体及经蛋白质工程改造的突变体。脂肪酶可产自腐质菌属(又名嗜热真菌属)如棉状嗜热丝孢菌或腐质霉(EP 258 068 and EP 305 216)；假单孢菌属如产碱假单孢菌(WO 96/13580)；类产碱假单孢菌如洋葱假单孢菌(EP331 376)、斯氏假单孢菌(GB 1,372,034)、荧光假单孢菌、假单孢菌属(WO95/06720和WO 96/27002)以及芽孢杆菌属如枯草芽孢杆菌(Dartois et al.(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)等。其它例子是脂肪酶变异物，例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中所描述的。可用的较好的商品脂肪酶有LIPOLASETM、LIPOLASE ULTRATM和LIPEXTM(诺维信A/S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以工业规模生产酶的方法，包括：ａ）用含有一或多种预水解复合氮源的发酵培养基通过微生物发酵的方式生产所需要的酶，这些复合氮源要与含碳水化合物的其他营养源分开灭菌。向复合氮源中添加酸类物质或水解酶以达到所述预水解的目的；ｂ） 从发酵培养液中回收所需酶。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：莫根斯沃普尔曼，尼尔斯班克，索伦迈克尔森，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]