新的生成肽的酶、生成该酶的微生物和利用它们合成二肽的方法技术

来源于选至稳杆菌属和鞘氨醇杆菌属的微生物的酶，能从羧组分和胺组分来合成肽。并且，提供了使用该酶从羧组分和胺组分来合成二肽的方法。本发明专利技术涉及不经过复杂合成方法就能简单、廉价和高产地生产肽的新酶。更具体地，本发明专利技术提供从羧组分和胺组分催化肽生成反应的新的酶、产生该酶的微生物，及用该酶或微生物生产二肽的廉价方法。从新近发现的属于稳杆菌属的微生物中发现了新的高效生成肽的酶，和发现了可廉价和简单地生产肽的方法。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及不经过复杂的合成方法就能简单、廉价和高产地生产肽的新酶。更具体地，本专利技术涉及从羧组分和胺组分催化肽生成反应的新酶、生产该酶的微生物，及用该酶或微生物生产二肽的方法。
技术介绍
肽在制药领域、食品领域和多种其他领域中得到应用。例如，由于L-丙氨酰-谷氨酰胺比L-谷氨酰胺具有更高的稳定性和水溶性，因此其作为输液和无血清培养基的组分得到使用。已知的生产肽的化学合成方法，总是不易进行。这种方法的已知实施例包括使用N-苯氧基羰基丙氨酸(在下文，“Z-丙氨酸”)和经保护的L-谷氨酰胺(参见Bull.Chem.Soc.Jpn.，34，739(1961)，Bull.Chem.Soc.Jpn.，35，1966(1962))的方法，和使用Z-丙氨酸和经保护的L-谷氨酸-γ-甲酯(参见Bull.Chem.Soc.Jpn.，37，200(1964))的方法，和使用Z-丙氨酸和非保护的谷氨酸(参见日本公开专利申请号H1-96194)的方法，以及包含源自作为原料的2-取代-丙酰卤化物的中间体的N-(2-取代)-丙酰谷氨酰胺衍生物的合成方法(参见公开专利申请号H6-234715)。然而，这些方法都需要引入和消除保护基或使用光学活化中间体，就工业应用而言它们并不尽人意。另一方面，使用酶的肽生成法的代表性公知的实施例包括使用N-保护和C-非保护的羧基组分、和N-非保护、C-保护的胺组分的缩和反应(在下文，“反应1”)，使用了N-保护、C-保护的羧基组分和N-非保护、C-保护的胺组分的取代反应(在下文，“反应2”)。反应1的实施例是由Z-天冬氨酸和苯基丙氨酸甲酯生成Z-天冬氨酰苯基丙氨酸甲酯的方法(参见日本公开专利申请号S53-92729)，而反应2的实施例是由乙酰苯基丙氨酸乙酯和亮氨酸酰胺生成乙酰苯丙氨酰亮氨酸酰胺的方法(参见Biochemical J.，163，531(1977))。据报道很少有关于使用N-非保护、C-保护的羧基组分的实施例方法的研究。国际公开专利WO90/01555描述了使用N-非保护、C-保护的胺组分的取代反应(在下文，“反应3”)的实施例。例如，可提及由精氨酸乙酯和亮氨酰胺生成精氨酰亮氨酸的方法。欧洲公开专利EP278787A1和EP359399B1描述了使用N-非保护、C-保护的羧基组分和N-非保护、C-非保护的胺组分的取代反应(在下文，“反应4”)的实施例。例如，可提及由酪氨酸乙酯和丙氨酸生成酪氨酰丙氨酸的方法。
技术实现思路
在上述的反应1至4的方法中，最廉价的生产方法自然属于反应4的一类，其包含最少的保护基。然而，现有技术(欧洲公开专利EP278787A1)中反应4的实例有以下主要问题(1)极慢的肽生产率，(2)肽产率低，(3)能生成的仅限于那些具有较高疏水性的氨基酸的肽，(4)所加入的酶量极大，和(5)需要衍生于霉菌、酵母或植物的较昂贵的羧肽酶制剂。在反应4中，没有使用衍生于细菌或是酵母属的酵母之外的其他酵母的酶的已知方法，也没有生成丙氨酰谷氨酰胺和其他亲水性高的肽的已知方法。考虑到这种背景，需要发展工业上生产这些肽的廉价方法。本专利技术的目的是提供新的不经过复杂合成方法就能简单、廉价和高产地生产肽的酶。更具体地，本专利技术的目的是提供新的从羧组分和胺组分催化肽生产反应的酶、生产该酶的微生物，和用该酶或微生物生产肽的廉价方法。本专利技术的专利技术人通过针对上述目的通过锐意研究从源自新近发现的、属于稳杆菌属(Empedobacter)等的细菌中找到了新的有效生产肽的酶，并完成本专利技术。本专利技术如以下所述。来自稳杆菌属或鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)的酶，其具有由羧基组分和胺组分生成肽的能力。能由羧基组分和胺组分生成肽的酶，在条件(i)至(iv)下生成二肽的反应中，其能以0.03mM/min或更高的产率来生成L-丙氨酰-谷氨酰胺；(i)羧基组分是100mM的L-丙氨酸甲酯氢氧化物；(ii)胺组分是200mM的L-谷氨酰胺；(iii)pH是9.0；和，(iv)加入的酶量，作为蛋白质少于0.61mg/ml。根据或的酶，其中作为底物的羧基组分包括氨基酸酯和氨基酸酰胺。根据至任一项的酶，其中作为底物的胺组分包括任意一种氨基酸、C-保护的氨基酸和胺。根据至任一项的酶，其中该酶在pH6.5至10.5的范围具有生成肽的能力。根据至任一项的酶，其中该酶能在温度0至60℃的范围具有生成肽的能力。根据至任一项的酶，其中丝氨酸酶抑制物、苯基甲磺酰氟化物不能抑制该酶，但p-硝基苯-p’-胍基苯甲酸盐能抑制该酶。根据至任一项的酶，其中该酶具有通过SDS-凝胶电泳确定的约75千道尔顿的分子量，和通过凝胶过滤层析法确定的约150千道尔顿的分子量。一种微生物，能产生根据至任一项的酶。根据的微生物，其中，微生物是短稳杆菌(Empedobacterbrevis)菌株FERM BP-8113(保藏单位独立行政法人产业综合技术研究所，国际专利微生物保藏中心，保藏单位地址日本茨城县筑波市东1-1-1，中央第6，国际保藏提交日期2002年7月8日)或鞘氨醇杆菌菌株(Sphingobacterium sp.)FERM BP-8124(保藏单位独立行政法人产业综合技术研究所，国际专利微生物保藏中心，保藏单位地址日本茨城县筑波市东1-1-1，中央第6，国际保藏提交日期2002年7月22日)。生产二肽的方法，包括用根据至任一项的酶或含有该酶的物质，由羧基组分和胺组分生成二肽。附图简述附图说明图1是表示本专利技术的酶的最适pH图；图2是表示本专利技术的酶的最适温度图；和图3是表示由L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酰胺生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的时程图。实施专利技术的最佳方式依次详细解释实施本专利技术的最佳方式(1)能产生本专利技术中的酶的微生物，(2)微生物的培养，(3)酶的纯化，(4)酶性质，和(5)二肽合成方法。(1)能产生本专利技术中的酶的微生物本专利技术中的酶可以是能由羧基组分和胺组分生成肽的任意的酶，对生产该酶的微生物没有特别的限制。在本说明书中，羧基组分指为肽健(-CONH-)提供羰基位点(CO)的组分，而胺组分指在肽键提供氨基位点(NH)的组分。另外，在本说明书中，除非另有特别说明，单独用到的术语“肽”指有至少一个肽键的聚合体。另外，在本说明书中，术语“二肽”指有一个肽键的肽。能产生本专利技术中的酶的微生物实施例包括属于稳杆菌等属的细菌，其中具体实施例包括短稳杆菌菌株ATCC 14234(菌株FERM P-18545)，和鞘氨醇杆菌菌株FERM BP-8124。短稳杆菌菌株ATCC 14234(菌株FERM P-18545，菌株FERM BP-8113)和鞘氨醇杆菌菌株FERMBP-8124是本专利技术的专利技术者筛选的，能由羧基组分和胺组分高收率地生产肽的微生物的研究结果。具有短稳杆菌菌株ATCC 14234(菌株FERMP-18545)或鞘氨醇杆菌菌株FERM BP-8124的类似细菌学特征的微生物，也是能产生本专利技术中酶的微生物。短稳杆菌菌株ATCC 14234(菌株FERM P-18545)已于2001年10月1日在独立行政法人产业综合技术研究所，国际专利微生物保藏中心(日本茨城县筑波市东1-1-1，中央第6)得到保藏，保藏号为FERMP-18545。根据布达佩本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶，其来源于稳杆菌属（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ）或鞘氨醇杆菌属（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）的微生物、并具有从羧基组分和胺组分生成肽的能力。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：横关健三，铃木园子，原诚一，片山智，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]