编码磷酸烯醇丙酮酸:糖类磷酸转移酶系统蛋白质的谷氨酸棒杆菌基因技术方案

本发明专利技术描述了分离的编码新的谷氨酸棒杆菌ＰＴＳ蛋白的核酸分子，该分子被称为ＰＴＳ核酸分子。本发明专利技术也提供了反义核酸分子，含有ＰＴＳ核酸分子的重组表达载体，以及已导入表达载体的宿主细胞。本发明专利技术也进一步提供了分离的ＰＴＳ蛋白，ＰＴＳ突变蛋白，融合蛋白质，抗原肽，以及基于谷氨酸棒杆菌ＰＴＳ基因遗传工程提高由该生物体进行的所需化合物生产的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分离的编码新的谷氨酸棒杆菌PTS蛋白的核酸分子。本专利技术也涉及反义核酸分子，含有PTS核酸分子的重组表达载体，以及已导入表达载体的宿主细胞。本专利技术也进一步涉及分离的PTS蛋白，PTS突变蛋白，融合蛋白质，抗原肽，以及基于谷氨酸棒杆菌PTS基因遗传工程提高由该生物体进行的所需化合物生产的方法。
技术介绍
细胞中天然存在的代谢过程中的特定产物和副产物，在很多行业中具有用途，包括食品、饲料、化妆品和制药产业。这些分子总称为“精细化学物质”，包括有机酸、蛋白源的和非蛋白源的氨基酸、核苷酸和核苷、脂质和脂肪酸、二醇、糖类、芳香族化合物、维生素和辅因子以及酶。可以通过大规模培养产生并分泌大量特定所需分子的细菌，最方便的制备这些产品。用于这一目的的一种特别有用的生物体就是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，一种革兰氏阳性非病原菌。通过菌株筛选，出现了许多产生大批所需化合物的突变株。然而，为改进特殊分子生产而进行的菌株筛选，是一个耗时并且困难的过程。
技术实现思路
本专利技术提供了新的细菌核酸分子，这些分子具有多种用途。这些用途包括鉴定可以产生精细化学物质的微生物、调节谷氨酸棒杆菌或者亲缘细菌中的精细化学物质的产生、谷氨酸棒杆菌或者亲缘细菌的分型和鉴定、作为绘制谷氨酸棒杆菌基因组图谱的参照点。这些新的核酸分子编码蛋白质，此处称为磷酸烯醇丙酮酸糖类磷酸转移酶系统(PTS)蛋白质。谷氨酸棒杆菌是一种革兰氏阳性需氧细菌，通常在工业中被用于大规模生产各种精细化学物质，也用于降解烃类(例如在石油泄漏中)和氧化萜品醇。因此，本专利技术的PTS核酸分子，可用来鉴定能用于生产精细化学物质的微生物，例如通过发酵方法。调节本专利技术PTS核酸分子的表达，或者修饰本专利技术PTS核酸分子的序列，可以用于调节微生物中一种或者多种精细化学物质的生产(例如，提高棒杆菌或者短杆菌中一种或者多种精细化学物质的产生)。本专利技术PTS核酸分子可用于鉴定一种微生物是否是谷氨酸棒杆菌或者其亲缘菌株，或者鉴定微生物混合群体中谷氨酸棒杆菌或者其亲缘菌株的存在。本专利技术提供了许多谷氨酸棒杆菌基因的核酸序列；在严格条件下，用探针探查从单一微生物或者混合微生物群体培养物中提取的基因组DNA，该探针覆盖了谷氨酸棒杆菌基因特有的一段区域，可以确定是否有该微生物存在。尽管谷氨酸棒杆菌本身是非病原性的，但是它与人体中的病原菌种有关，例如白喉棒状菌(Corynebacterium diphtheriae)(白喉致病原)；探测这种微生物具有重大的临床实用性。本专利技术PTS核酸分子也可以用作绘制谷氨酸棒杆菌基因组图谱的参照点，或者绘制其亲缘菌株基因组图谱的参照点。相似的，这些分子，或者其变体或其部分，可以用作遗传工程棒杆菌或者短杆菌的遗传标记。例如，本专利技术新核酸分子编码的PTS蛋白，能够把像是葡萄糖这样的高能量含碳分子转运进谷氨酸棒杆菌，或者参与该微生物中的细胞内信号传导。考虑到可在谷氨酸棒杆菌中使用的克隆载体的实用性，例如在Sinskey et al.，美国专利编号No.4,649,119中公开的，并且考虑到谷氨酸棒杆菌和亲缘短杆菌菌种(例如乳发酵短杆菌)的遗传操作技术(Yashihama et al，J.Bacteriol.162591-597(1985)；Katsumata et al.，J.Bacteriol.159306-311(1984)；以及Santamaria et al.，J.Gen.Microbiol.1302237-2246(1984))，本专利技术的核酸分子可用于该生物体的遗传工程，使之成为一种或者多种精细化学物质更好的或者更有效的生产者。可以修饰本专利技术的PTS分子，从而使得一种或者多种精细化学物质的产量、生产和/或生产效率得到提高。例如，通过修饰一种参与葡萄糖摄取的PTS蛋白，可以优化其活性，使得葡萄糖摄取数量或者葡萄糖被转运进细胞的速率得到提高。细胞内葡萄糖或者其他糖类降解可以提供能量，这些能量可用于推动能量不利的生化反应，例如那些涉及精细化学物质生物合成的反应。降解也提供了某些精细化学物质生物合成所必需的中间体或者前体分子，例如氨基酸、维生素和辅因子。通过修饰本专利技术PTS分子以增加细胞内高能碳分子的数量，既可以增加完成生产一种或者多种精细化学物质所必需的代谢途径的能量供给，又可以增加这种生产所需要的细胞内代谢物质库。另外，本专利技术PTS分子可以参与一条或者多条细胞内信号传导途径，这些信号传导途径可以影响谷氨酸棒杆菌中一种或者多种精细化学物质的产量和/或生产速率。例如，一旦细胞内存在足够数量的糖类，从细胞外介质中输入一种或者多种糖类所必需的蛋白质(例如，HPr，Enzyme I，或者Enzyme II复合体中的一种成分)经常被翻译后修饰，从而使它们不能再把糖输入到细胞内。当转运系统关闭时糖的数量，对于维持细胞正常功能来说可能是足够的，这可能限制了所需化学物质的过量生产。因此，修饰本专利技术PTS蛋白而使其对这种负调节不再有反应是很值得做的，所以，允许细胞内一种或者多种糖达到更高的浓度，并且通过反应延伸，从含有这种PTS蛋白突变体的生物体中，便可以更加有效的生产或者更大产量的获得一种或者多种精细化学物质。本专利技术提供了新的编码蛋白质的核酸分子，这种蛋白质在此处称作磷酸烯醇丙酮酸糖类磷酸转移酶系统(PTS)蛋白质，它们参与把高能碳分子(例如，葡萄糖、果糖、蔗糖)输入谷氨酸棒杆菌，和/或参与一条或者多条谷氨酸棒杆菌细胞内信号传导途径。这些蛋白质的实例，包括那些在表1中列出的基因所编码的蛋白质。因此，本专利技术的一个方面涉及，分离含有一段编码一种PTS蛋白或者其生物活性部分的核酸序列的核酸分子(例如，cDNA，DNA，或者RNA)，以及分离适合作为探测或扩增PTS编码核酸(例如DNA或者RNA)的引物或者杂交探针的核酸片段。在特别优选的实施方案中，分离的核酸分子包含一段列在序列表中的序列号为奇数的核酸序列(例如，SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7)或者一条这种核苷酸序列的编码区域或者其互补序列。在其他特别优选的实施方案中，分离的本专利技术核酸分子包含与序列表中的序列号为奇数的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7)或者其部分有至少大约50％同源性，优选的有至少大约60％的同源性，更优选的有至少大约70％，80％，或90％的同源性，甚至更优选的有至少大约95％，96％，97％，98％，99％或者更高的同源性。在其他优选的实施方案中，已分离的核酸分子编码列在序列表中的偶数序列号氨基酸序列(例如，SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8)。本专利技术优选的PTS蛋白也优选具有至少一种此处描述的PTS活性。在另一个实施方案中，已分离的核酸分子编码一种蛋白质或者其部分，其中的蛋白质或者其部分包含一段氨基酸序列，该序列与本专利技术的氨基酸序列(例如，在序列表中偶数序列号的序列)有充分的同源性，例如，与本专利技术的氨基酸序列有充分的同源性而使得该蛋白质或者其部分具有PTS活性。优选，核酸分子编码的蛋白质或者其部分本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含选自ＳＥＱＩＤＮＯ：５、ＳＥＱＩＤＮＯ：７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５、ＳＥＱＩＤＮＯ：２ ７和ＳＥＱＩＤＮＯ：２９的核酸序列或其互补序列的分离的谷氨酸棒杆菌核酸分子。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M波姆佩朱斯，B克雷格尔，H施雷德尔，O策尔德，G哈贝豪尔，
申请(专利权)人：BASF公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]