血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，是以水产罗非鱼片加工后鱼骨上的残肉为原料，选用具有特定作用位点，水解能力强的蛋白内切酶和肽链内切酶进行酶解制备；本发明专利技术实现了水产生物资源的高效增值利用，降低了成本，实现了对酶解过程的控制，提高了产物对血管紧张素转化酶的抑制率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生化
，具体的说涉及一种。
技术介绍
血管紧张素转化酶(ACE)可分为组织ACE和血浆ACE，ACE的基本作用是转化血管紧张素I和降解缓激肽。非活性的10肽血管紧张素I，经由ACE的作用，通过脱去C端His-Leu二肽，由血管紧张素I转化成为有生物活性的血管紧张素II，而血管紧张素II是已知最强的升压活性物质。利用ACE抑制剂可以抑制血管紧张素II的生成，可以减少缓激肽的失活，因此可以有效地控制高血压。目前，国内已报导了一些食物蛋白质来源的ACE抑制肽的制备方法吴建平、丁霄霖(1998)以大豆蛋白为材料，利用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶等12种蛋白酶进行ACEIP的单酶和双酶酶解制备，筛选出一种能产生较高ACEI活性的酶E，得到酶解产物上清液的半抑制浓度为1.20mg/mL。广州轻工业研究所从利用牛奶蛋白制备ACE抑制肽，体外ACE抑制实验表明IC50＜40ug/mL；动物实验表明，无论单次或连续给样(口服)，对肾血管狭窄型高血压大鼠(RVHR)均有显著降压作用，对正常大鼠的血压无明显影响(于江虹，2000)。辛志宏、马海乐、吴守一等(2003)用碱性蛋白酶水解小麦胚芽蛋白得到的水解物对ACE有强的抑制活性(IC50＝0.014mg/ml)，对产物分离纯化得到序列为Ala-Met-Tyr的小分子肽，其IC50＝0.014mg/ml。于娅、杨瑞金和王璋(2004)以新鲜无壳牡蛎为原料酶法制备牡蛎短肽，浓度为0.4mg/mL的牡蛎功能短肽的ACE抑制率为51.4％。许庆陵、曾庆祝和崔铁军等(2004)以鲢鱼头为原料，利用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和复合风味蛋白酶制备ACE抑制肽，结果认为胃蛋白酶为酶解鲢头制备ACE抑制肽的理想蛋白酶；其最佳酶解工艺条件为温度37℃、pH＝2.0、酶解时间3h、酶的质量分数为14％、底物浓度w(原料)∶w(水)＝1∶3，在该条件下得到的产物对ACE的抑制率达到83.58％。范俊峰、李里特和张艳艳(2004)等报道了2种工业化酶ProteaseA和OrientaseB的大豆蛋白水解物的高活性ACEI肽的筛选工作，其中OrientaseB水解大豆蛋白10h，其产物的ACE抑制活性最高达到95％，ProteaseA的最高也可达到91.33％。ProteaseA水解4～10h的产物以及OrientaseB水解6～10h的产物，是由2～5个氨基酸组成的寡肽，ACE的抑制活性高，且苦味轻微或没有。现有的大多存在酶解时间长，酶解过程和时间难以控制，产物对AE的抑制率低等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有存在的问题，提供一种新的血管紧张素转化酶抑制肽制备方法。本专利技术的是采用Trypsin、Alcalase2.4L、Protamex中的两种酶酶解罗非鱼片加工后鱼骨上的残肉制备得到。具体地是采用Trypsin与Alcalase2.4L、Alcalase2.4L与Protamex、或Trypsin与Protamex两种酶酶解所述残肉制备得到。本专利技术方法更具体地包括如下步骤(1)将所述残肉与水按质量比1∶2混合，匀浆，沸水加热；(2)调节浆液的pH至8.0-8.5，温度为35-45℃，加入Trypsin，酶解1～2小时；(3)调节浆液的pH＝6.5-7.5，温度为45-45℃，加入Protamex，酶解4～5小时；(4)加热、过滤。本专利技术也可以采用如下步骤(1)所述残肉与水按质量比1∶2混合，匀浆，沸水加热；(2)调节浆液的pH＝8.0-8.5，温度为55-65℃，加入Alcalase2.4L，酶解1～2小时；(3)调节浆液的pH＝6.5-7.5，温度为45-55℃，加入Protamex，酶解4～5小时；(4)加热、过滤。本专利技术还可以采用如下步骤(1)所述残肉与水按质量比1∶2混合，匀浆，沸水加热；(2)调节浆液的pH＝8.0-8.5，温度为35-45℃，加入Trypsin，酶解1～2小时；(3)调节浆液的pH＝7.5-8.5，温度为55-65℃，加入Alcalase2.4L，酶解4～5小时；(4)加热、过滤。本专利技术酶解得到的产物经Sephadex G-15分离，并测定各分离组分的IC50值，其中Trypsin与Alcalase2.4酶解产物经分离得到的3G组分抑制效果较好；3G组分经Sephadex G-15再次分离和测定各分离组分的抑制率，其中3GIII组分抑制率高且含量高；3GIII组分经RP-HPLC分离和测定各分离组分的抑制率，最后得到组分3GIII8经MS(电喷雾质谱)分析，其中多肽的分子量范围主要为200-450之间，经MS-MS(电喷雾串联质谱)分析其中含有Thr-Cys、Asp-Trp、Glu-Met、分子量为315的三肽和分子量为432的四肽。本专利技术的有益效果在水产加工过程中存在大量下脚料，没有得到充分的利用，造成大量优良蛋白质资源的浪费，本专利技术以该水产加工下脚料罗非鱼残肉为原料，选用具有特定作用位点，水解能力强的蛋白内切酶和肽链内切酶进行ACE抑制肽的制备；本专利技术的制备方法充分利用了水产下脚料罗非鱼残肉作为原料，实现水产生物资源的高效增值利用，节约了成本；对内切酶与肽链内切的分步使用，实现对酶解过程和时间的控制，提高了产物对ACE的抑制率。Trypsin与Alcalasa2.4L、Trypsin与Protamex及Alcalase2.4L与Protamex分别分步控制酶解的产物经处理后稀释40倍后对ACE的最大抑制率可达到82.9％、82.9％和91.91％。具体实施例方式实施例1以水产加工过程中的罗非鱼肉残为原料，按质量比1∶2加入水，匀浆，沸水加热；调节浆液的pH＝8.0，温度为40℃，加入Trypsin，酶解2小时；调节浆液的pH＝7.0，温度为50℃，加入Protamex，酶解4小时。Trypsin与Protamex双酶分步酶解I值随酶解的进行起伏比较大，酶解后1小时，酶解产物I值达到最大82.9％。经加热灭酶冷却后，高速离心(14000转/min)得到上清液，取上清液15mL，加入7mL经水饱和的正己烷，充分摇匀混和静置萃取，收集下层液，经离心(12000r/min)取上清液10mL冻干，得到的样品标为1号。1号样品经Sephadex G-15分离，得到下列组分 实施例2以水产加工过程中的罗非鱼残肉为原料，按质量比1∶2加入水，匀浆，沸水加热；调节浆液的pH＝8.0，温度为60℃，加入Alcalase2.4L，酶解2小时；调节浆液的pH＝7.0，温度为50℃，加入Protamex，酶解4小时。Alcalase2.4L与Protamex双酶分步酶解酶解2小时，酶解产物的I值为70.45％；酶解6小时，酶解产物的I值为91.91％，达到最大。经加热灭酶冷却后，高速离心(14000转/min)得到上清液，取上清液15mL，加入7mL经水饱和的正己烷，充分摇匀混和静置萃取，收集下层液，经离心(12000r/min)取上清液10mL冻干，得到的样品标为2号。2号样品经Sephadex G-15分离，得到下列组分 实施例3以水产加工过程中的罗非鱼残肉为原料，按质量比1∶2加入水，匀浆，沸水加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于采用Ｔｒｙｐｓｉｎ、Ａｌｃａｌａｓｅ２．４Ｌ、Ｐｒｏｔａｍｅｘ中的两种酶酶解罗非鱼片加工后鱼骨上的残肉制备得到。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾庆孝，朱志伟，林奕封，阮征，张立彦，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]