一种林麝复合微生态冻干制剂的制备方法及应用技术

本发明专利技术是在发明专利技术人前期工作的基础上，对林麝复合微生态制剂的制备方法进行了改进和应用试验，本发明专利技术提供了一种林麝复合微生态制剂的新剂型。本发明专利技术的实际内容是：林麝复合微生态冻干制剂的制备，包括15%冻干保护剂的配制、复合微生态制剂的制备、复合微生态冻干制剂在小鼠上的应用试验、复合微生态冻干制剂在林麝上的应用试验。本发明专利技术首次研制了一种林麝复合微生态冻干制剂的制备方法。采用冷冻干燥法，使菌株的活力更好的得以延续，有助于保持它们原有的生物学特性，利于在临床实践中的应用，因此具有较大的应用价值。

A deer compound microecological preparation and application of lyophilized preparation

The invention is based on the previous work on the improvement and inventor, application test of compound musk deer preparation method of probiotics, the new formulation of probiotics a compound of musk deer. The actual content of the invention is: musk compound microecological preparation of freeze-dried, including 15% cryoprotector preparation, compound probiotics preparation, compound microecological lyophilized preparation in mice, application test on compound microecological lyophilized preparation in the application of forest musk deer. The present invention is developed for the first time a deer compound micro ecological method for preparation of freeze-dried preparations. Freeze drying method can make the vitality of strains continue, which helps to maintain their original biological characteristics, and is conducive to the application in clinical practice, so it has great application value.

【技术实现步骤摘要】
一种林麝复合微生态冻干制剂的制备方法及应用
本专利技术属于微生态饲料添加剂，涉及一种林麝复合微生态冻干制剂的制备方法及其应用。
技术介绍
林麝(Moschusberezovskii)别名香獐、林獐、麝鹿等。它不仅是国家一级保护珍稀野生动物，而且也是珍贵药用麝属动物之一。然而在利益的驱使下，大肆滥捕，致使野生林麝数量急剧下降。人工养殖是麝类资源保护的主要对策之一，虽然我国从1953年以来就开展了人工养麝保护及利用麝资源的研究，但由于疾病对人工规模化、产业化养麝的困扰，仍然没有形成规模化养殖，其中仔麝肠炎是引起仔麝死亡的严重疾病之一，幼麝在产下一周后逐渐发生，轻者含奶瓣、糊状，加重后逐渐变黄、变稀、带粘液、带血丝，粪便具有恶臭味，幼麝精神萎靡、食欲减退、脱水、受蚊虫追逐、体质衰弱，发病率从20%-30%不等，病死率为30%，日龄越小死亡率越高。因此，从根本上解决长期困扰人工规模化养麝快速发展的麝肠炎疾病已迫在眉睫。虽然药物在治疗仔麝肠炎上大量应用，但是仍然不能根本解决问题，而且抗生素的滥用导致诸多的不良反应，如：诱发细菌耐药、导致二重感染、损害动物机体组织器官、破坏肠道正常菌群以及动物源食品的安全隐患及环境污染等问题。目前，滥用抗生素已成为一个世界性的问题，我们迫切需要解决这一问题。随着动物微生态学的不断发展，以有益微生物菌群研制开发的饲用微生态制剂，作为一类新型绿色无公害饲料添加剂已被广泛应用于畜牧业等各个领域。研究表明，与抗生素相比，微生态制剂具有提高畜禽生产能力、无毒、无耐药性、无药物残留等诸多优点，是抗生素的有益替代品，在未来畜牧业发展中有着广泛的应用前景。但是在生产实践中乳酸菌菌种保藏成活率较低，乳酸菌活菌数的降低，达不到预期效果。冷冻干燥法具有其他方法无法比拟的优点，其保存期长，是制备和保存菌种的最有效的方法之一，得到越来越广泛的应用。冷冻干燥法(简称“冻干法”)，其基本原理是菌体与保护介质混溶，在共溶点以下预冻，然后在低于三相点压力的高度真空下，使菌品中的冰品升华，除去菌品中的多余水分，获得一定含水量的干燥发酵剂，使菌种的新陈代谢活动处于高度静止状态，菌体细胞结构成分保持原来状态。本专利技术通过对林麝复合微生态制剂的冻干保存方法的探索，使菌株的活力更好的得以延续，有助于保持它们原有的生物学特性，利用临床实践中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种林麝复合微生态制剂的冻干保存方法，理想的微生态制剂标准的其中一条指出活菌含量至少应达108CFU/mL，经复合微生态制剂冻干保存的活菌数监测试验表明，随着储存时间的推移，微生态制剂活菌数呈现出明显下降的趋势，在-20℃冰箱中冻干保存135d后下降到1.08×108CFU/mL，该林麝复合微生态制剂的冻干保存方法解除了在运输过程中和实际生产中保存条件的限制。此外，通过复合微生态制剂在小鼠和腹泻林麝上的应用试验表明，冻干保存后的林麝复合微生态制剂，在小鼠肠内能快速增值，对腹泻林麝达到了缓解、治疗的效果。通过以上试验为该复合微生态制剂在林麝上的应用提供了依据，因此该复合微生态制剂具有较大的应用价值。具体实施步骤：1.林麝复合微生态冻干制剂的制备方法。1）15%冻干保护剂的配制：分别称取10g脱脂乳，5g蔗糖，定容至100mL，121℃，15min灭菌备用。2）复合微生态制剂的制备：分别将S2（植物乳酸菌）、S3（嗜酸乳杆菌）、MRS2-2（明串球菌）3株乳酸菌在MRS固体培养基经37℃，厌氧培养48h后，每个平板分别加入2mL的冻干保护剂，用无菌棉签洗下三种乳酸菌培养物，各自分别装入无菌锥形瓶中，混匀。之后三种乳酸菌分别进行平板计数，计数完毕，三种不同的乳酸菌按照1:1:2的比例混匀，吸取1mL（3.78×1010CFU/mL）入安瓿瓶中，制得复合微生态制剂。3）复合微生态制剂的真空抽干：把装有复合微生态制剂的安瓿瓶置于-20℃冰箱冷冻12h，取出置于抽干机中进行真空抽干24-48h，之后取出复合微生态制剂立刻进行封口，封口完毕后置于-20℃冰箱保存备用。具体实施方式实施例一：林麝复合微生态冻干制剂的制备方法及其应用的检测。1.性状检测对按上述方法制得的林麝复合微生态冻干制剂进行性状检测，冻干制剂为淡黄色粉末。2.卫生指标的检测对制备得到的林麝复合微生态冻干制剂进行卫生指标的检测，包括有害化学物质指标的检测，比如铅（Pb）、汞（Hg）、镉（Cd）、砷（总砷）、黄曲霉素B1的允许量，和有害或致病微生物的检测，比如杂菌和致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌等。以上各项指标分别根据国标《微生物饲料添加剂技术通则(NY/T1444—2007)》提出的卫生指标要求和检测方法进行的检测，检测结果表明，林麝复合微生态制剂冻干制剂符合卫生指标的标准。3.芽孢杆菌的检测对芽孢杆菌的检测参照国标《食品卫生微生物学检验菌落总数测定(GB/T4789.2—2003)》，检测结果表明，林麝复合微生态制剂冻干制剂符合卫生指标的标准。4.林麝复合微生态冻干制剂活菌数检测将制备完成的林麝复合微生态冻干制剂和林麝复合微生态液态制剂分为A、B两个组（两组的活菌数均为3.78×1010CFU/mL），两组微生态制剂均存放于-20℃条件下，每隔15d进行活菌数检测，林麝复合微生态制剂不同剂型活菌数随时间变化结果图1。由图1所示，林麝复合微生态冻干制剂在-20℃条件下保存，随着储存时间的推移，微生态制剂活菌数呈现明显的下降趋势。当存放时间至45d时，A组的活菌数下降到1.13×109CFU/mL，而B组的活菌数下降到6.35×107CFU/mL。理想的微生态制剂标准的其中一条指出活菌含量至少应达108CFU/mL；由此，我们选择对林麝复合微生态制剂进行剂型改进，把林麝复合微生态制剂制备成冻干制剂，并置于-20℃条件下进行保存。当存放时间至135d后A组活菌数下降到1.08×108CFU/mL，所以，此复合微生态制剂的保存期为135d。5.安全性检验取5周龄的SPF级BALB/c小鼠16只，体重22-24g，雌雄各半，购自成都达硕实验动物有限公司，24只小鼠被随机分成A、B两组，每组8只；其中A组为安全检验试验组，B组为空白对照组。小鼠正常饲养观察5d无异常后进行安全检验试验，A组小鼠每天每只使用0.2mL复合微生态制剂灌胃1次，连续7d。B组小鼠每天每只以相同剂量的生理盐水灌胃1次，连续7d，仔细观察小鼠的精神饮食和粪便情况。试验结果表明，A组小鼠与B组一样，精神状况、饮食情况及粪便状况均正常，无异常临床反应。在试验结束的前1d，禁食，自由饮水，将小鼠全部处死，解剖，肉眼观察发现A组与B组相比各个器官没有异常变化，无菌操作取胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠以及盲肠，生理盐水冲洗后，置于4%中性甲醛溶液中进行固定，包埋，切片，常规HE染色，镜下观察各组织器官的切片。A组小鼠组织器官切片（胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠以及盲肠）均未见病理变化（见图2-图8）。6.小鼠复合微生态制剂的应用取5周龄的SPF级BALB/c小鼠24只，体重22-24g，雌雄各半，购自成都达硕实验动物有限公司。24只小鼠被随机分成2大组，4小组，每组6只；2大组分别为A组、生理盐水对照组，小鼠在正常饲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种林麝复合微生态冻干制剂的制备方法及应用，此方法使菌株的活力更好的得以延续，有助于保持它们原有的生物学特性，利于在临床实践中的应用；其特征在于：本专利技术中我们对林麝复合微生态制剂制备成冻干制剂并采用冷冻干燥法进行保存。

【技术特征摘要】
1.一种林麝复合微生态冻干制剂的制备方法及应用，此方法使菌株的活力更好的得以延续，有助于保持它们原有的生物学特性，利于在临床实践中的应用；其特征在于：本发明中我们对林麝复合微生态制剂制备成冻干制剂并采用冷冻干燥法进行保存。2.权利要求1所述的林麝复合微生态冻干制剂的制备方法及应用，主要包括如下步骤：（1）15%冻干保护剂的配制；（2）复合微生态制剂的制备；（3）复合微生态制剂的真空抽干；（4）复合微生态制剂置于-20℃冰箱保存；（5）复合微生态冻干制剂在小鼠上的应用试验；（6）复合微生态冻干制剂在林麝上的应用试验。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，15%的冻干保护剂的配制由以下步骤完成：分别称取10g脱脂乳，5g蔗糖，定容至100mL，121℃，15min灭菌备用。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，复合微生态制剂的制备由以下步骤完成：分别将S2（植物乳酸菌）、S3（嗜酸乳杆菌）、MRS2-2（明串球菌）3种乳酸菌在MRS固体培养基上经37℃，厌氧培养48h，每个平板分别加入2mL的冻干保护剂，用无菌棉签洗下三种乳酸菌培养物，各自分别装入无菌锥形瓶中，混匀；之后三种乳酸菌分别进行平板计数，计数完毕，三种不同的乳酸菌按照1:1:2的比例混匀，吸取1mL（3.78×1010CFU/mL）入安瓿瓶中，制得复合微生态制剂。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，复合微生态制剂的真空抽干由以下步骤完成：把装有复合微生态制剂的安瓿瓶置于-20℃冰箱冷冻12h，取出安瓿瓶立刻放入抽干机进行真空抽干24-48h，之后取出抽干的复合微生态制剂立刻进行封口。6.根据权利要求5所述的林麝复合微生态冻干制剂在小鼠上的应用试验为：5周龄的SPF级BA...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗燕，田青，程建国，赵位，周鑫，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51