本发明专利技术公开了一株专一性降解（Ｓ）－扁桃酸的芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＥＣＵ１００８（ＣＧＭＣＣＮｏ．１３８７）和一株专一性降解（Ｒ）－扁桃酸的假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＥＣＵ１００９（ＣＧＭＣＣＮｏ．１３８８）及其用途。利用本发明专利技术提供的菌株来拆分扁桃酸外消旋体，具有操作简单安全、成本低廉、目标产物容易纯化及对环境友好等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株芽胞杆菌和一株恶臭假单胞菌及其用途。
技术介绍
扁桃酸(α-羟基苯乙酸)是一种重要的制药中间体。较之扁桃酸的消旋体，其单一对映体(右旋或左旋的扁桃酸)的使用价值更高。因此，如何能简便高效地获得扁桃酸的单一对映体成为研究热点。美国专利4,322,548提到了一种利用光学活性苯甘氨酸酯和苯甘氨酸酯盐酸盐作为拆分剂，通过与扁桃酸形成非对映异构体来达到拆分扁桃酸的目的，此方法的缺点是必须使用昂贵的手性拆分剂和大量的有机溶剂，而且拆分步骤比较繁琐；文献J.Chem.Soc.Perkin TransI.1992，2253-2255报道了脂肪酶在有机相中催化转酯化拆分扁桃酸及其衍生物，获得光学纯度≥97％ee的(S)-(+)-扁桃酸和≥99％ee的(R)-(-)-扁桃酸，但此方法的缺点是反应时间较长，转化率不高；文献Appl.Environ.Microbiol.1991，57(10)，3028-3032报道了利用粪产碱杆菌细胞催化消旋体扁桃腈选择性水解生成光学纯(R)-(-)-扁桃酸，其缺点是存在安全隐患。因此，如何能简便、安全和高效地获得扁桃酸的单一对映体成为本专利技术需要解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术目的之一在于，提供能选择性降解(S)-(+)-或(R)-(-)-扁桃酸的菌株；本专利技术目的之二在于，提供一种应用上述菌株拆分扁桃酸外消旋体的方法。本专利技术的专利技术人从土壤中，经初筛、复筛及分离纯化，获得一株能选择性降解外消旋扁桃酸中(S)-(+)对映体的芽胞杆菌(Bacillus sp.)ECU1008，该菌株在2005年6月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1387；同样，专利技术人通过筛选从土壤中获得另一株能选择性降解外消旋扁桃酸中(R)-(-)对映体的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ECU1009，该菌株在2005年6月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1388。CGMCC No.1387菌株具有如下特征1、大小形态杆状，大小2～3μm，在产芽孢培养基中培养数天后产梭状芽孢，革兰氏染色阳性；2、适合生长环境可在温度10～40℃，pH5～9、NaCl浓度0～7％(w/v)环境中生存；3、平板培养菌落特性同心圆状；突脐状；黄色。CGMCC No.1388菌株具有如下特征1、大小形态杆状，大小2～3μm，不产芽孢，革兰氏染色阴性；2、适合生长环境可在温度10～40℃，pH5～9、NaCl浓度0～7％(w/v)环境中生存；3、平板培养菌落特性圆形，边缘整齐；低凸面；乳白色。CGMCC No.1387菌株或CGMCC No.1388菌株在拆分扁桃酸外消旋体中的应用，其主要步骤如下将CGMCC No.1387菌株或CGMCC No.1388菌株按1～10v/v％接种量接种至生物转化培养基，于20～40℃(优选25～35℃)状态下保持1～5天(优选2～3天)后经离心除去菌体后得水相，调节所得水相pH值小于3后，经萃取后得(R)-(-)-或(S)-(+)-扁桃酸；其中所说的生物转化培养基为外消旋扁桃酸0.1～5wt％，玉米浆0.1～2wt％，NH4NO30.1～0.5wt％，K2HPO40.1～0.5wt％，KH2PO40.1～0.5wt％，NaCl 0.1～0.5wt％，MgSO40.1～0.5wt％，余量为水。在本专利技术中，CGMCC No.1387菌株或CGMCC No.1388菌株在用于拆分扁桃酸外消旋体前最好在由葡萄糖0.1～3wt％，蛋白胨0.1～3wt％，酵母膏0.1～3wt％，外消旋扁桃酸0.1～3wt％，K2HPO40.1～0.5wt％，KH2PO40.1～0.5wt％，NaCl 0.1～0.5wt％，MgSO40.1～0.5wt％，琼脂0～2wt％和余量为水组成的预培养基中进行预培养，预培养的温度20～40℃，预培养的时间为1～6天。利用本专利技术公开的两株细菌及类似的工艺，还可以拆分扁桃酸衍生物的消旋体，如对羟基扁桃酸、对氯扁桃酸、间氯扁桃酸和邻氯扁桃酸等消旋体。采用本专利技术所用的生物转化工艺，不仅能简单方便地获得高纯度的(R)-或(S)-扁桃酸，而且生产成本比现有技术的低，是一种具有广泛应用前景的生产方法，可以满足迅速发展的医药工业的需要。具体实施例方式以下通过实施例对本专利技术的
技术实现思路
作进一步的描述。其目的仅在于更好理解本
技术实现思路
，而非限制本专利技术的保护范围实施例1菌株的筛选取少量土壤稀释液上清涂平板(含富集培养基，其组成为苯甲酰甲酸2.0g，(NH4)2SO42.0g，K2HPO41.0g，NaCl 1.0g，MgSO40.5g，琼脂20g，自来水1000ml，pH7.0)，在25～40℃下倒置培养2～4天，挑单菌于丰富培养基平板上培养1～2天，再将单菌落接种至液体发酵培养基(甘油15.0g，蛋白胨5.0g，酵母膏5.0g，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NaCl 1.0g，MgSO40.5g，自来水1000ml，pH7.0)中培养24小时，离心收集菌株Bacillus sp.ECU1008或Pseudomonas putida ECU1009。实施例2将Bacillus sp.ECU1008(CGMCC No.1387)菌株接种至40ml生长培养基(葡萄糖1.5wt％，蛋白胨0.5wt％，酵母膏0.5wt％，K2HPO40.1wt％，KH2PO40.1wt％，NaCl 0.1wt％，MgSO40.05wt％，其余为水，pH7.0)中，30℃、160rpm摇床上预培养12h后，加入0.5％外消旋扁桃酸做为诱导物，继续培养12h；以该培养液为种子，按10v/v％的接种量接种至40ml转化培养基(消旋扁桃酸20.0g，玉米浆1.0g，NH4NO3，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NaCl1g，MgSO40.5g，水1000ml，pH7.0)中，30℃下160rpm摇床上发酵转化2天。反应结束后以10000×g离心10min，收集上清液，旋转蒸发除去大部分水，用50％硫酸酸化浓缩液至pH1～2，再以食盐饱和，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发掉有机溶剂得结晶粗品，通过硅胶柱层析(苯∶乙酸乙酯∶甲酸，体积比10∶2∶1)纯化后，得纯品(R)-扁桃酸380mg，产率46.5％。实施例3将Pseudomonas putida ECU1009(CGMCC No.1388)菌株接种至40ml营养培养基(葡萄糖1.5wt％，蛋白胨0.5wt％，酵母膏0.5wt％，K2HPO40.1wt％，KH2PO40.1wt％，NaCl0.1wt％，MgSO40.05wt％，其余为水，pH7.0)中，30℃、160rpm摇床上预培养12h，加入0.5％扁桃酸做为诱导物，继续培养12h，以该培养液为种子，按10％的接种量接种至40ml转化培养基(消旋扁桃酸10.0g，玉米浆1.0g，NH4NO3，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NaCl1g，MgSO40.5g，自来水1000ml，pH7.0)中，28℃下160rpm摇床上培养2天。反应结束后10本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＥＣＵ１００８，其保藏号为：ＣＧＭＣＣＮｏ．１３８７。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许建和，黄汉荣，徐毅，潘江，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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