具有产生L-氨基酸能力的埃希氏菌属细菌以及生产L-氨基酸的方法技术

本发明专利技术涉及具有产生Ｌ－氨基酸能力的埃希氏菌属细菌和使用该细菌生产Ｌ－氨基酸的方法，其中所述细菌产生Ｌ－氨基酸的能力通过增加Ｌ－氨基酸分泌蛋白的表达量得以提高。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请号为99127522.5、申请日为1999年12月30、专利技术名称为“生产L-氨基酸的方法”的专利技术专利申请的分案申请。本专利技术涉及生产氨基酸的方法。具体而言，本专利技术涉及属于埃希氏菌属的产L-氨基酸细菌和使用该细菌生产L-氨基酸的方法，更具体而言是生产L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的方法。为了通过发酵生产L-氨基酸，使用了分离自自然界的菌株或该菌株的人工突变体来提高产量。例如，在生产L-赖氨酸时，已知有多种产L-赖氨酸的人工突变体，其中大多数是S-2-氨乙基半胱氨酸(AEC)抗性突变体，属于短杆菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属或埃希氏菌属。而且，已提出了一些增加氨基酸产量的途径，如使用通过重组DNA法获得的转化体(美国专利4,278,765)。这些途径多数基于提高参与氨基酸生物合成途径的酶的活性，使该酶转变成对抑制不敏感等(关于埃希氏菌属细菌，参见日本专利申请公开号56-18596(1981)和国际公开WO 95/16042)。另一方面，作为通过增加氨基酸分泌蛋白而提高氨基酸产率的例子，已知有一种属于棒杆菌属的细菌，其中L-赖氨酸分泌蛋白基因LysE被增加。然而，对于属于埃希氏菌的细菌，甚至还不知道是否存在L-氨基酸分泌蛋白。因此，使用埃希氏菌属细菌时，不知道增加L-氨基酸分泌蛋白对L-氨基酸生产是否有效。尽管属于埃希氏菌属的大肠杆菌K-12菌株的全部核苷酸序列已经确定(Science，277，1453-1474，1997)，但其中有大量蛋白的功能还不知道。本专利技术的目的是获得参与L-氨基酸分泌的蛋白，从而提供L-氨基酸产率提高的菌株和通过发酵生产L-氨基酸的改良方法。专利技术人已对参与L-氨基酸分泌的蛋白进行了筛选。结果，专利技术人发现当增强一种特定基因时，基于消耗的糖的L-氨基酸产量增加了。基于这一发现完成了本专利技术。因此，本专利技术提供了具有产生L-氨基酸能力的埃希氏菌属细菌，其中产L-氨基酸的能力通过增加至少一种选自以下(A)到(H)的蛋白的表达量而得到提高(以下称为“本专利技术的细菌”)(A)具有序列表中SEQ ID NO10所示的氨基酸序列的蛋白；(B)具有在序列表中SEQ ID NO10所示氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、置换、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，该蛋白具有增加含该蛋白的细菌产生L-氨基酸的能力的活性；(C)具有序列表中SEQ ID NO12所示的氨基酸序列的蛋白；(D)具有在序列表中SEQ ID NO12所示氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、置换、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，该蛋白具有增加含该蛋白的细菌产生L-氨基酸的能力的活性；(E)具有序列表中SEQ ID NO14所示的氨基酸序列的蛋白；(F)具有在序列表中SEQ ID NO14所示氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、置换、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，该蛋白具有增加含该蛋白的细菌产生L-氨基酸的能力的活性；(G)具有序列表中SEQ ID NO16所示的氨基酸序列的蛋白；或(H)具有在序列表中SEQ ID NO16所示氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、置换、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，该蛋白具有增加含该蛋白的细菌产生L-氨基酸的能力的活性。本专利技术的细菌优选一种产L-赖氨酸细菌，其中选自(A)到(D)，(G)和(H)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-谷氨酸细菌，其中选自(A)到(H)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-丙氨酸细菌，其中选自(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-缬氨酸细菌，其中选自(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-组氨酸细菌，其中选自(C)到(F)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-脯氨酸细菌，其中选自(A)到(F)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-苏氨酸细菌，其中选自(E)和(F)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-精氨酸细菌，其中选自(G)和(H)的至少一种蛋白的表达量增加；或一种产L-异亮氨酸细菌，其中选自(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加。优选，本专利技术的细菌中编码细胞中所述蛋白的DNA的拷贝数量增加。该DNA优选携带于细胞中的多拷贝质粒或转座子上。本专利技术还提供了生产L-氨基酸的方法，包括以下步骤在培养基中培养本专利技术的细菌，在培养基中产生和积累L-氨基酸；由培养基中回收L-氨基酸(以下也称为“本专利技术的细菌”)。本专利技术的方法优选一种使用产L-赖氨酸细菌生产L-赖氨酸的方法，所述细菌中选自(A)到(D)，(G)和(H)的至少一种蛋白的表达量增加；一种使用产L-谷氨酸细菌生产L-谷氨酸的方法，所述细菌中选自(A)到(H)的至少一种蛋白的表达量增加；一种使用产L-丙氨酸细菌生产L-丙氨酸的方法，所述细菌中选自(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加；一种使用产L-缬氨酸细菌生产L-缬氨酸的方法，所述细菌中选自(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加；一种使用产L-组氨酸细菌生产L-组氨酸的方法，所述细菌中选自(C)到(F)的至少一种蛋白的表达量增加；一种使用产L-脯氨酸细菌生产L-脯氨酸的方法，所述细菌中选自(A)到(F)的至少一种蛋白的表达量增加；一种使用产L-苏氨酸细菌生产L-苏氨酸的方法，所述细菌中选自(E)和(F)的至少一种蛋白的表达量增加；一种使用产L-精氨酸细菌生产L-精氨酸的方法，所述细菌中选自(G)和(H)的至少一种蛋白的表达量增加；或一种使用产L-异亮氨酸细菌生产L-异亮氨酸的方法，所述细菌中选自(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加。优选，本专利技术的方法中编码细菌细胞中所述蛋白的DNA的拷贝数量增加。该DNA优选携带于细胞中的多拷贝质粒或转座子上。根据本专利技术，埃希氏菌属细菌产L-氨基酸的能力可以被提高。生产L-氨基酸的方法的L-氨基酸的产率也可以被提高。以下详述本专利技术。以下除非另外说明氨基酸指L-构型。(1)本专利技术的细菌本专利技术的细菌是具有产生氨基酸能力的埃希氏菌属细菌，其中产生氨基酸的能力通过增加一种蛋白的表达量得以提高，所述蛋白具有增加所述细菌产生氨基酸能力的活性，或增加对氨基酸或氨基酸类似物的抗性的活性。以下，为方便起见该蛋白被称为“氨基酸分泌蛋白”。但使用该术语并不意味着该蛋白的功能仅限于氨基酸分泌。氨基酸分泌蛋白的实例包括具有SEQ ID NO10所示氨基酸序列的蛋白，具有SEQ ID NO12所示氨基酸序列的蛋白，具有SEQ ID NO14所示氨基酸序列的蛋白，具有SEQ ID NO16所示氨基酸序列的蛋白。氨基酸分泌蛋白对氨基酸可以具有选择性。适合于每一种氨基酸的氨基酸分泌蛋白可以通过以下方法确定让氨基酸分泌蛋白在属于埃希氏菌属并具有产氨基酸能力的细菌中表达，测定氨基酸产量的增加或者氨基酸或氨基酸类似物的最小抑制浓度(MIC)的增加。例如，在氨基酸为赖氨酸时，具有SEQ ID NO10，12或16所示氨基酸序列的蛋白是有效的；在氨基酸为谷氨酸时，具有SEQ IDNO10，12，14或16所示氨基酸序列的蛋白是有效的；在氨基酸为丙氨酸时，具有SEQ ID NO12所示氨基酸序列的蛋白是有效的；在氨基酸为缬氨酸时，具有SE本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有产生Ｌ－氨基酸能力的埃希氏菌属细菌，其中产生Ｌ－氨基酸能力通过增加选自以下（Ｃ）和（Ｄ）蛋白的至少一种蛋白的表达量得到提高：（Ｃ）具有序列表中ＳＥＱＩＤＮＯ：１２所示的氨基酸序列的蛋白；和（Ｄ）具有在序列表中ＳＥＱ　 　ＩＤＮＯ：１２所示氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、置换、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，该蛋白具有增加含该蛋白的细菌产生Ｌ－氨基酸的能力的活性。

【技术特征摘要】
RU 1998-12-30 98124016;RU 1999-3-9 991044311.具有产生L-氨基酸能力的埃希氏菌属细菌，其中产生L-氨基酸能力通过增加选自以下(C)和(D)蛋白的至少一种蛋白的表达量得到提高(C)具有序列表中SEQ ID NO12所示的氨基酸序列的蛋白；和(D)具有在序列表中SEQ ID NO12所示氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、置换、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，该蛋白具有增加含该蛋白的细菌产生L-氨基酸的能力的活性。2.权利要求1的细菌，其中所述L-氨基酸为L-赖氨酸，并且选自所述蛋白(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加。3.权利要求1的细菌，其中所述L-氨基酸为L-谷氨酸，并且选自所述蛋白(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加。4.权利要求1的细菌，其中所述L-氨基酸为L-丙氨酸，并且选自所述蛋白(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加。5.权利要求1的细菌，其中所述L-氨基酸为L-缬氨酸，并且选自所述蛋白(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加。6.权利要求1的细菌，其中所述L-氨基酸为L-组氨酸，并且选自所述蛋白(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加。7.权利要求1的细菌，其中所述L-氨基酸为L-脯氨酸，并且选自所述蛋白(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加。8.权利要求1的细菌，其中所述L-氨基酸为L-异亮氨酸，并且选自所述蛋白(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加。9.权利要求1到8任一项的细菌，其中细胞中编码所述蛋白的DNA的拷贝数增加。...

【专利技术属性】
技术研发人员：VA利夫希茨，NP扎卡塔瓦，中西一夫，VV阿列申，PV特罗申，IL托克马科瓦，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]