从微生物菌体回收高纯度聚羟基链烷酸酯的方法技术

本发明专利技术的目的在于提供一种从含有ＰＨＡ的微生物菌体中有效地除去ＰＨＡ粒子以外的菌体构成成分，能够以高收率得到不引起严重的分子量降低、高纯度的ＰＨＡ的ＰＨＡ的分离.精制方法，进而得到ＰＨＡ粒子的凝聚体的方法。本发明专利技术的ＰＨＡ的回收方法，是通过将含有ＰＨＡ的微生物细胞的水性悬浮液在低温下进行物理破碎和碱添加，有效地破碎菌体细胞，回收ＰＨＡ后，用酶和／或表面活性剂进行处理。另外，可以将ＰＨＡ悬浮于亲水性溶剂和／或水中，通过在该悬浮液的沸点或沸点以下的温度搅拌，使之凝聚，加大ＰＨＡ的粒度。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及从微生物细胞中分离·回收具有生物降解性的聚酯类树脂的方法以及该树脂粒子的凝聚方法。
技术介绍
聚羟基链烷酸酯(以后简称为PHA)是在很多种微生物的细胞内，作为能量积蓄物质而生成、积蓄的热塑性聚酯。由微生物将天然的有机酸或油脂生产成为碳源的PHA，是通过土中或水中的微生物完全地生物降解，并纳入自然界的碳循环过程，因此被称为对生态系统几乎没有不良影响的环境调和型塑料材料。近年，合成塑料从环境污染、废弃物处理、石油资源的观点来看，已到了成为严重社会问题的程度，PHA作为对环境无污染的绿色塑料备受关注，并热切地期望其实用化。另外，在医疗领域，也认为可以利用于作为不需要回收的植入物材料、药物载体等生物体适用性塑料，并期待实用化。微生物生产的PHA由于通常作为颗粒体在微生物细胞内蓄积，为了使PHA作为塑料利用，则需要从微生物细胞内分离取出PHA的工序。作为从微生物细胞中分离精制PHA的已知方法，如果大致区分，可以分为通过使用PHA可溶性有机溶剂从微生物细胞中提取PHA的方法，和破碎或可溶化而除去PHA以外的细胞构成成分而得到PHA的方法。在初期的研究中，大量报道了利用通过有机溶剂的提取进行PHA的分离精制方法(特开昭55-118394号公报、特开昭57-65193号公报、特开昭63-198991号公报、特开平02-69187号公报、特开平07-79788号公报)。在这些报告中，作为PHA的溶解度最高的有机溶剂，使用氯仿等卤素化合物，但是，将PHA溶解于该溶剂中时，溶液的粘性变得非常高，操作困难。因此，在PHA的提取时，需要在聚合物浓度为2～3％左右的极稀的条件下进行处理，因此需要非常大量的溶剂。另外，为了从溶剂层以高的回收率使PHA结晶析出，还另外需要上述溶剂的4～5倍容量的大量的甲醇或己烷等不良溶剂，因此，工业生产需要大规模的设备。另外，由于溶剂的使用量庞大，则溶剂回收成本和损失溶剂的成本增加，从不能廉价制造PHA等理由来看，此方法不能实用化。另一方面，还报道了各种将PHA以外的细胞构成成分通过化学处理或物理破碎处理使之可溶化并除去，将PHA按颗粒体原样的状态回收的方法。作为化学处理微生物细胞(下面也称为菌体)的方法，在J.Gen.Microbiology，1958年，第19卷，p.198-209中记载了用次氯酸钠处理菌体悬浮液将PHA以外的菌体构成成分可溶化，从而获得PHA的方法。此方法中，虽然使PHA以外的菌体构成成分的可溶化，但是与此同时由于引起PHA的显著的分解，导致了对制品的加工的限制。另外，由于在PHA内残留不能忽视的氯的臭味，故被认为作为制品不为优选，由此可以看出不适合于实际应用。在特公平04-61638号公报中，示出了将热处理和酶、表面活性剂同时使用的回收法，此方法中，通过酶处理溶解菌体时，由于游离的核酸悬浮液变得非常的粘稠，因此需要预先将悬浮液在100℃或100℃以上加热，分解核酸。可是，通过在100℃或100℃以上的加热，PHA显著地低分子化，使得不能够应用于制品。另外，此方法不仅非常的复杂、需要很多的工序，而且得到的PHA的纯度大致为88％，最大也仅为97％左右。另外，还提出了将含有PHA的微生物菌体用表面活性剂处理之后，将从菌体放出的核酸用过氧化氢在80℃下处理3小时进行分解，分离99％纯度的PHA的方法(特表平08-502415号公报)、和将含有PHA的微生物悬浮液在pH不到2的强酸性下、在50℃或50℃以上加热后，分离PHA的方法(特开平11-266891号公报)。在这些热处理条件下，由于PHA的分子量显著降低，即使纯度提高了，也变得不能应用于制品。另一方面，作为使用物理破碎的方法，报导了高压破碎或组合高压破碎与添加碱的方法。Bioseparation，1991年，第2卷，p.95-105中，虽然没有记载聚合物的纯度和回收率，但由于在含有聚-3-羟基丁酸(PHB)的菌体悬浮液中添加碱后，将pH返回中性，进行高压破碎，菌体构成成分在PHB级分中残存，可以预想纯度不会高。在特开平07-31487号公报中公开了，添加碱后在80℃加热，搅拌1小时后使用离心分离回收聚合物的方法；特开平07-31488号公报中公开了，在70℃进行高压破碎的方法；特开平07-31489号公报中，公开了被认为是发展了Bioseparation，1991年，第2卷，p.95-105的方法，即，在添加碱后，在70℃或70℃以上进行高压破碎的方法。这些方法中，由于在高温下进行处理，根据条件，可以发现PHA的分子量有显著降低的倾向，而且纯度也降低至66～85％左右，不能应用于实际的工业化工艺中。从上述可知，从培养后的菌体将PHA进行不发生低分子化、而且高纯度收率良好地、在工业上廉价地回收是极其困难的。可是，不使用溶剂提取，即，在将PHA以外的菌体构成成分通过化学处理或物理处理使之可溶化并除去，PHA以颗粒体的原样状态回收的方法中，得到的PHA通常是直径数微米的微细粒子。从液体介质中分离这样的微细粒子时，与粒子更大的场合相比是困难的。另外，考虑到这些微粒引起粉尘爆炸的危险性和/或呼吸时在肺中的积蓄等，在使用时需要注意。为了避免这样的问题，作了使PHA凝聚，粒度变大的尝试，例如，开发了通过加热或碱金属盐的凝聚法等。作为加热凝聚的方法，是将含有PHB的悬浮液加热到PHB的熔点附近(180℃)，使之凝聚的方法(Bailey，Neil A.；George，Neil；Niranjan，K.；Varley，Julie.Biochemical Engineering group，University Reading，「IChemE Res.Event，Eur.Conf.Young Res.Chem.Eng.」，(英国)，第2版，Institution of Chemical Engineers，1996年，第1卷，p.196-198)。另外，特表平07-509131号公报中，公开了在悬浮于水中的3-羟基丁酸(3HB)和3-羟基戊酸(3HV)的共聚物(以下称为PHBV)中，将适当的温度和压力的蒸汽直接注入，通过在120～160℃加热搅拌，提高PHBV的粒度的方法。这些方法由于需要在高温下加热，PHA的分子量降低明显，而且由于需要具有耐压性的特别的装置，所以不实用。另外，作为添加碱金属盐凝聚PHA的方法，公开了用2价的阳离子凝聚的方法(J.Biotechnol.，1998年，第65(2，3)卷，p.173-182、特表平05-507410号公报)，但是这些方法，由于聚合物的凝聚强度未必强、以及在聚合物中混入金属盐等，故不为优选。另外，还报道了通过向PHB悬浮液中吹入超微细气泡使PHB凝聚，使絮状物浮上来的方法(参照Spec.Publ.-R.Soc.Chem.，1994年，158卷(Separations for Biotechnology 3)，p.113-119)。可是，据此得到的凝聚体为2～45μm，不能说充分大。故此，现在的现状是，抑制PHA分子量降低，并且能够有效地进行凝聚的方法仍然不知道。如上所述，对于来自微生物的生物降解性聚合物的PHA的开发，在从微生物细胞回收PHA的工序、另外视需要而凝聚PHA粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种回收聚羟基链烷酸酯的方法，该回收方法是包含下述（ａ）及（ｂ）工序的、从含有聚羟基链烷酸酯的微生物细胞中回收聚羟基链烷酸酯的方法，（ａ）在含有聚羟基链烷酸酯的微生物细胞的水性悬浮液中，边进行搅拌和物理的破碎处理边添加碱，破碎该细胞 ，同时使该细胞中的聚羟基链烷酸酯以外的细胞物质可溶化或乳化，接着将聚羟基链烷酸酯从悬浮液中分离的工序；（ｂ）将分离的聚羟基链烷酸酯用酶和／或表面活性剂进行处理，将附着在聚羟基链烷酸酯上的杂质可溶化或分解后可溶化，接着用亲水性溶剂和／ 或水洗净聚羟基链烷酸酯的工序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳田义文，小川典子，上田恭义，小坂田史雄，松本圭司，
申请(专利权)人：株式会社钟化，
类型：发明
国别省市：JP[日本]