一种基于纯微生物处理的高效利用木聚糖转化生物丁醇的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于纯微生物处理的高效利用木聚糖转化生物丁醇的方法，主要包括：(1)从红树林环境获取红树林底泥样品；(2)在厌氧条件中将底泥样品加入到木聚糖为唯一碳源的发酵培养基中，进行驯化富集培养稳定的微生物菌群；(3)将稳定的微生物菌群接种到新的木聚糖发酵培养基中；进行发酵培养，再高压蒸汽灭菌；(4)将已筛选的纯培养梭菌菌株WST活化，并接种到步骤(3)所得发酵液中，再进行联合发酵转化目标产物——生物丁醇。本发明专利技术能以木聚糖为唯一碳源进行生长，并显著提高其生物可利用率以及生物丁醇的转化率，而且操作过程简单方便，且不产生二次污染，具有广阔应用前景和潜力。

A method of efficient use of xylan to convert biological butanol based on pure microbial treatment

The invention relates to a method which includes, efficient use of xylan conversion bio butanol pure microbial treatment based on: (1) obtain mangrove sediment samples from the mangrove environment; (2) fermentation culture under anaerobic conditions in the sediment samples were added to xylan as sole carbon source medium, were stable enrichment culture the microbial flora; (3) the stability of the bacteria inoculated into the xylan fermentation new medium; fermentation, high-pressure steam sterilization; (4) the pure culture of Clostridium strain WST has been screened for activation, and inoculated to step (3) in the fermentation broth, then combined fermentation the target product of bio butanol. The invention can grow with xylan as sole carbon source, and significantly increase its bioavailability and bioconversion rate of butanol, and has simple and convenient operation process, and does not generate two pollution. It has broad application prospects and potential.

【技术实现步骤摘要】
一种基于纯微生物处理的高效利用木聚糖转化生物丁醇的方法
本专利技术属于微生物生物技术及生物能源发酵
，涉及一种基于纯微生物处理的高效利用木聚糖转化生物丁醇的方法。
技术介绍
随着石油等不可再生资源的日益消耗，开发新能源已经逐渐成为人类生存与发展的迫切需求。作为可再生能源之一，生物燃料通常指由生物质组成或转化的各种固体、液体或气体燃料的总称。其除了具有良好的可贮藏性和可运输性，还具有可循环性和环保性两大优点，是替代化石燃料的最佳选择，也是生物质能开发利用的重要方向之一。在众多生物燃料中，生物丁醇以其腐蚀性小、不易吸水、便于管道运输、挥发性低、燃烧值高等优点成为了理想的生物燃料燃油替代品。但就目前来说，传统的丁醇发酵过程存在的主要问题之一是依赖于可食用的粮食原料，如玉米淀粉等，这就部分造成了工业生产与人类生存共同竞争粮食作物的窘状，同时也很大程度增加了丁醇发酵的生产成本。因此寻找廉价的非粮食依赖型原料便成了解决这一问题的重点。木质纤维素生物质是自然界中来源最为广泛的生物质，但是大部分的木质纤维素未被有效利用，或者直接作为堆肥原料，造成了严重的资源浪费和环境污染，而针对木质纤维素生物质的有效利用也一直是当今世界性尚待解决的难题之一。为了进一步减轻对化石燃料的依赖，利用木质纤维素生物质转化生物能源也引起了人们更为广泛的关注。作为构成木质纤维素生物质的主要成分之一，半纤维素是除纤维素外含量最为丰富的杂多糖，占木质纤维素生物质总量的25％–35％，是第二丰富的可再生生物质。而木聚糖是构成半纤维素的主要成分，因此有效利用木聚糖将成为有效利用木质纤维素生物质中重要的一步。传统方法是将木聚糖进行化学法水解，再将水解产物进一步发酵转化为生物能源物质。化学水解方法因其简单、快速而被普遍使用，但其水解过程中会伴随某些抑制物的产生，如4-羟基苯甲醛，羟甲基糠醛等，进而影响后续发酵或转化反应，抑制木聚糖向生物能源的转化过程。因此如何采用温和且无污染的处理方法，高效利用木聚糖转化生物能源便成为了目前亟待解决的问题。但是由于木质纤维素生物质自身的高聚合复杂结构加大其水解难度，其水解利用效率不高一直是目前众多尚待解决难题之一；而且木质纤维素生物质成分复杂，仅依赖单一酶制剂无法实现其高效利用，且酶制剂成本过高，不利于工业大规模应用；另外利用单一微生物菌株直接处理木质纤维素生物质的能力有限，几乎无法实现较高的底物利用率及生物丁醇转化率。而造成现有报道技术主要存在以下缺点：1、木质纤维素生物质中的半纤维素(主要成分为木聚糖)富含各类杂多糖，其结构较为复杂，酶水解成本过高，增加发酵工艺条件和成本；2、酸碱等化学处理方式过于剧烈，容易导致底物中可利用的成分结构遭到破坏并产生抑制菌株发酵的物质(如糠醛)，因而影响后期的发酵效果；3、菌株直接利用木聚糖的底物利用率较低，生物丁醇转化率不高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对木质纤维素生物质转化生物能源研究的基础上，提供一种纯微生物处理技术，该技术能提高木质纤维素生物质的主要成分之一木聚糖的生物利用率，结合联合发酵的手段，高效转化为生物丁醇，实现底物到产物的高转化率，解决现有技术存在的问题。为了实现上述的目的，采用如下的技术方案：一种基于纯微生物处理的高效利用木聚糖转化生物丁醇的方法，主要包括以下步骤：(1)从红树林环境获取红树林底泥样品；(2)在厌氧条件中将红树林底泥样品加入到木聚糖为唯一碳源的发酵培养基中，并置于37℃、150rpm的培养条件下进行驯化富集培养稳定的微生物菌群；(3)将步骤(2)驯化富集培养的稳定的微生物菌群以5％的接种量接种到新的木聚糖发酵培养基中；置于37℃、150rpm的培养条件下进行发酵培养6-8天，再置于115℃条件下高压蒸汽灭菌15min；(4)纯培养梭菌菌株WST活化，并以2％的接种量接种到步骤(3)所得发酵液中，再放置于30℃、150rpm的培养条件下继续联合发酵培养7-8天。菌群只是起到提高木聚糖的水解效果，对菌株WST有一定的抑制作用。进一步的，步骤(1)所述驯化富集培养稳定的微生物菌群的方法为：通过检测所产生的生物气体和发酵产物来分析微生物菌群的生长情况并进行传代，待微生物菌群产气量及产物成分比例稳定后，则停止传代并最终获取稳定的能利用木聚糖为底物的微生物菌群。进一步的，木聚糖为唯一碳源的发酵培养基中，主要的组成成分为：木聚糖,20g/L；NaHCO3,2.52g/L；酵母提取物,10g/L；100×盐溶液(NaCl1.0g/L；MgCl2·6H2O,0.5g/L；KH2PO4,0.2g/L；NH4Cl,0.3g/L；KCl,0.3g/L；CaCl2·2H2O,0.015g/L),10mL；1000×微量元素溶液(FeCl2·4H2O,1.5g/L；CoCl2·6H2O,0.19g/L；MnCl2·4H2O,0.1g/L；ZnCl2,0.07g/L；H3BO3,0.006g/L；Na2MoO4·2H2O,0.036g/L；NiCl2·6H2O,0.024g/L；CuCl2·2H2O,0.002g/L)1mL；2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES),1.952g/L。所述木聚糖为唯一碳源的发酵培养基的制备方法为：先将其主要的组成成分加入蒸馏水使其完全溶解并定容至1000mL，在此过程中保持N2的持续通入，然后最后依次加入用于最终除氧的还原剂Na2S·9H2O,0.048g/L；L-半胱氨酸(Cys)，0.0242g/L和DL-二硫苏糖醇(DTT)0.077g/L，并用4mol/L的HCl调节pH值至6.0，分别封装到厌氧培养用的血清瓶中，于121℃灭菌20min后冷却备用。进一步的，传到第10代菌群基本稳定则停止传代，最终获取的稳定菌群中微生物菌株种类的85％-90％属于Ruminococcus属，5-6％属于Clostridium属。进一步的，所述红树林底泥为表层10cm以下，用厌氧收集袋4℃存储运回实验室，并在24小时内于厌氧条件下进行处理。本专利技术是一种基于纯微生物处理的高效利用木聚糖转化生物丁醇的方法，主要涉及一个从红树林底泥环境中驯化获得稳定的微生物菌群，以及经灭活处理后同纯化梭菌菌株WST进行联合发酵，能以木聚糖为唯一碳源进行生长，并显著提高了木聚糖的生物可利用率，结合联合发酵的方式，大幅度提高木聚糖到生物丁醇的转化率，为木质纤维素类生物质的可持续利用提供了新的思路。本专利技术操作过程简单方便，且不产生二次污染，在利用木质纤维素生物质转化生产生物丁醇的工业应用上具有广阔前景和潜力。而现有的技术主要是采用化学试剂或酶制剂对木聚糖进行水解，然后再对水解产物加以利用和转化为生物丁醇等目的产物。本专利技术于现有的技术相比，具体如下：(1)与化学水解法相比：化学法水解速度较快，但是同时会产生抑制产物，且控制不得当，会造成利用该水解产物转化生物丁醇的效率严重下降；而本专利技术方法简单，易于操作，且条件温和无污染，对后续反应基本无不利影响；(2)与酶解法相比：直接使用酶解法，条件温和，但单一酶解效率较低，且成本较高，导致木聚糖转化率较低，无法实现生物能源的有效利用和高效转化；而本专利技术直接利用微生物菌群和单一菌株的联合发酵即可实现高效转化木聚糖为生物丁醇，除底物外，无需本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于纯微生物处理的高效利用木聚糖转化生物丁醇的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)从红树林环境获取红树林底泥样品；(2)在厌氧条件中将红树林底泥样品加入到木聚糖为唯一碳源的发酵培养基中，并置于37℃、150rpm的培养条件下进行驯化富集培养稳定的微生物菌群；(3)将步骤(2)驯化富集培养的稳定的微生物菌群以5％的接种量接种到新的木聚糖发酵培养基中；置于37℃、150rpm的培养条件下进行发酵培养6‑8天，再置于115℃条件下高压蒸汽灭菌15min；(4)将已筛选的纯培养梭菌菌株WST活化，并以2％的接种量接种到步骤(3)所得发酵液，再放置于30℃、150rpm的培养条件下继续联合发酵培养7‑8天。

【技术特征摘要】
1.一种基于纯微生物处理的高效利用木聚糖转化生物丁醇的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)从红树林环境获取红树林底泥样品；(2)在厌氧条件中将红树林底泥样品加入到木聚糖为唯一碳源的发酵培养基中，并置于37℃、150rpm的培养条件下进行驯化富集培养稳定的微生物菌群；(3)将步骤(2)驯化富集培养的稳定的微生物菌群以5％的接种量接种到新的木聚糖发酵培养基中；置于37℃、150rpm的培养条件下进行发酵培养6-8天，再置于115℃条件下高压蒸汽灭菌15min；(4)将已筛选的纯培养梭菌菌株WST活化，并以2％的接种量接种到步骤(3)所得发酵液，再放置于30℃、150rpm的培养条件下继续联合发酵培养7-8天。2.根据权利要求1所述基于纯微生物处理的高效利用木聚糖转化生物丁醇的方法，其特征在于，步骤(1)所述驯化富集培养稳定的微生物菌群的方法为：通过检测所产生的生物气体和发酵产物来分析微生物菌群的生长情况并进行传代，待微生物菌群产气量及产物成分比例稳定后，则停止传代并最终获取稳定的能利用木聚糖为底物的微生物菌群。3.根据权利要求1所述基于纯微生物处理的高效利用木聚糖转化生物丁醇的方法，其特征在于，所述木聚糖为唯一碳源的发酵培养基中，主要的组成成分为：木...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴奕瑞，孙崇然，陈自创，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：广东,44