一种多微生物分步发酵高效制备甘露糖酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种多微生物分步发酵高效制备甘露糖酸的方法，主要特征：在包含40～50g/L甘露糖和23～28g/L葡萄糖的魔芋稀酸水解液体系中，首先以休哈塔假丝酵母或酿酒酵母选择性地转化原料水解液中的葡萄糖至乙醇。当葡萄糖浓度低于3g/L及时终止反应并分离发酵液与酵母细胞，于上述已分离出的发酵液引入氧化葡萄糖酸杆菌在好氧条件下进行生物转化。其中，葡萄糖发酵产物乙醇能有效抑制后续的氧化葡萄糖酸杆菌对其自身发酵产物甘露糖酸的分解代谢，进而有效提高甘露糖酸的产品得率。采用本方法，葡萄糖发酵阶段产物乙醇不脱除，后续甘露糖酸得率超过74％，产品质量体积浓度可超过3％。

A method of high efficiency preparation of mannose acid by multi microbial stepwise fermentation

The main feature of the invention discloses a microbial method, preparation of mannose acid fermentation system: in high step contains 40 ~ 50g/L and 23 ~ 28g/L mannose glucose konjac dilute acid hydrolysis liquid system, first by Candida shehatae or yeast selective conversion of raw material in the hydrolysis of glucose to ethanol. When glucose concentration was lower than 3g/L, the reaction was stopped in time, and the fermentation broth and yeast cells were separated. Among them, ethanol from glucose fermentation product can effectively inhibit subsequent catabolism of gluconate bacilli to mannitonic acid of its own fermentation product, and then effectively improve the yield of mannose acid. By this method, the product ethanol was not removed, the subsequent mannose acid yield was over 74%, and the mass volume concentration of the product could exceed 3%.

【技术实现步骤摘要】
一种多微生物分步发酵高效制备甘露糖酸的方法一、
本专利技术涉及生物工程和化学工程领域，特别涉及一种多微生物分步发酵高效制备甘露糖酸的方法。二、
技术介绍
有机酸类是全球仅次于抗生素和氨基酸排行第三的发酵产品，市场空间巨大。其中，糖酸可由植物原料中的糖类组分经生物转化制取并广泛应用于食品、医药和饲料等行业，用作酸味剂、水泥减水剂、泥浆分散剂、玻璃清洗剂、冶金除锈剂、金属离子螯合剂以及生物基平台化合物。与传统的葡萄糖酸相比，甘露糖酸(盐)作为一种新兴的己糖酸具有其自身独特的加工与应用性能，其用途正在被不断发掘和拓展。甘露糖酸可由甘露糖经氧化制得。魔芋淀粉富含葡萄糖甘露聚糖(以下简称“葡甘聚糖”)，是目前一种理想的甘露糖酸生产原料。魔芋葡甘露聚糖中同时含有葡萄糖和甘露糖基(比例1：1.6)，经稀酸或者酶催化水解可生成葡萄糖和甘露糖混合糖液，再经微生物细胞催化或发酵可生成葡萄糖酸和甘露糖酸。当前，包括氧化葡萄糖酸杆菌株(Gluconobacteroxydans)等微生物菌株对葡萄糖和甘露糖两种糖组分催化产酸转化的性能十分相近，而所生成的葡萄糖(盐)与甘露糖酸(盐)的化工分离特征亦相似。因此，基于现有的技术和工艺，由魔芋等原料制备获得高纯度的甘露糖酸(盐)较为困难。三、
技术实现思路
专利技术目的：针对当前甘露糖酸生产技术的瓶颈，本专利技术的目的以富含甘露糖的植物原料，经酸水解制取单糖混合液，然后采用酵母选择性发酵脱除葡萄糖、氧化葡萄糖酸杆菌发酵甘露糖制取甘露糖酸的多微生物分步发酵方法以实现高效制取甘露糖酸产品的目的。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种多微生物分步发酵高效制备甘露糖酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)魔芋原料经过研磨后经的稀盐酸水解预处理，通过固液分离得到稀酸水解液其中包含大量的甘露糖和葡萄糖组分。(2)稀酸水解液经中和处理后接入酿酒酵母(Saccharomycescereiviase)或休哈塔假丝酵母(Candidashehatae)厌氧发酵生产生物乙醇。利用葡萄糖代谢阻遏抑制效应，葡萄糖被优先利用转化为乙醇，实时监测葡萄糖含量变化。当葡萄糖含量低于3g/L，则人工终止反应确保甘露糖被最大限度的保留。(3)在步骤(2)葡萄糖已被代谢的基础上，通过离心或超滤法分离酵母细胞，发酵液转入下一阶段生物转化。在上述过程中的发酵液体系中接入氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)在好氧条件下催化转化制备甘露糖酸(盐)。其中葡萄糖发酵产生的乙醇对氧化葡萄糖杆菌的发酵性能存在明显抑制作用但对甘露糖酸(盐)的得率有明显提升作用，未脱除乙醇发酵液甘露糖酸(盐)得率在70％以上。所述的一种多微生物分步发酵高效制备甘露糖酸的方法，其特征在于：所述的中和处理，其中，中和剂为含有钙、钾、钠的碱性物质。水解液中和后的pH值范围为6.5～7.0。所述葡萄糖发酵的菌种为酿酒酵母(Saccharomycescereiviase)或休哈塔假丝酵母(Candidashehatae)或以它为宿主菌的基因重组菌株或其它遗传改良菌株。所述的一种多微生物分步发酵高效制备甘露糖酸的方法，其特征在于：所述的甘露糖氧化菌株为氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)或以它为宿主菌的基因重组菌株或其它遗传改良菌株。所述的一种多微生物分步发酵高效制备甘露糖酸的方法，其特征在于：所述的葡萄糖、甘露糖、葡萄糖酸、甘露糖酸的定性和定量测定采用高效液相离子交换色谱法(CN201210012963.4)。有益效果：本专利技术利用不同微生物对葡萄糖和甘露糖生物利用与转化性能的差异，采用多微生物分步发酵方法，首先利用酵母细胞选择性地转化和消除植物原料水解液中的葡萄糖杂质，然后利用葡萄糖发酵产物乙醇有效抑制后续的氧化葡萄糖酸杆菌对其自身发酵产物甘露糖酸的分解代谢，进而有效提高甘露糖酸的产品得率和纯度，为植物资源高效生物转化生产新兴甘露糖酸产品提供了新方法和新技术。四、附图说明图1是以魔芋为原料，经稀盐酸水解后采取微生物分步发酵高效制备甘露糖酸的工艺流程示意图。五、具体实施方式实施案例1在250ml三角摇瓶体系中，加入50g/L甘露糖及30g/L葡萄糖溶液50mL。首先接入酿酒酵母至细胞浓度2g/L(干基)置于恒温反应器，170rpm，30℃进行厌氧乙醇发酵，反应16h葡萄糖浓度低于3g/L甘露糖剩余44.5g/L终止乙醇发酵反应。采用离心分离法，在6000rpm条件下离心10min使得酿酒酵母充分沉降。分离得到的包含大量甘露糖的乙醇发酵液接入氧化葡萄糖酸杆菌至细胞浓度8g/L(干基)，置于恒温反应器，220rpm，30℃进行全细胞催化。添加10g/L碳酸钙维持催化体系的pH值在4.5～6.0左右。反应直至甘露糖消耗完全时停止反应获得甘露糖酸产品液。产品中甘露糖酸的浓度达到35.8g/L，甘露糖的利用率达到100％，甘露糖酸的得率超过74％。实施案例2将1000g(干基)魔芋经机械研磨至粉末，转入15L不锈钢蒸煮釜，加入1.25％稀盐酸，固液比(1：10，w/v)充分浸渍。采用电夹套加热至120℃，反应60分钟后过滤得稀盐酸酸水解液，其中包含44.2g/L甘露糖及25.9g/L葡萄糖。稀酸水解液经氢氧化钙中和至pH值6.5后转入15L机械搅拌反应器。加入休哈塔假丝酵母至细胞浓度2g/L(干基)。控制反应温度28～30℃和机械搅拌速率300r/min，以高效液相色谱监水解液中的葡萄糖及甘露糖浓度并甘露糖的回收率。反应至12h酸水解液中葡萄糖的浓度低于2g/L，甘露糖回收率为94.1％。之后采取超滤法分离酵母并回收发酵液继续转入15L机械搅拌反应器。再加入80g碳酸钙粉末，接入活化后的氧化葡萄糖杆菌至细胞浓度8g/L(干基)，调整机械搅拌速率为400r/min和反应温度28～30℃，发酵24h得乙醇发酵液，其中甘露糖浓度低于2g/L，甘露糖酸浓度为30.9g/L，甘露糖酸得率达到71.2％，累计可以得到甘露糖酸约310g(干基)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多微生物分步发酵高效制备甘露糖酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)魔芋原料经过研磨后经的稀盐酸水解预处理，通过固液分离得到稀酸水解液其中包含大量的甘露糖和葡萄糖组分。(2)稀酸水解液经中和处理后接入酿酒酵母(Saccharomyces cereiviase)或休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)厌氧发酵生产生物乙醇。利用葡萄糖代谢阻遏抑制效应，葡萄糖被优先利用转化为乙醇，实时监测葡萄糖含量变化。当葡萄糖含量低于3g/L，则人工终止反应确保甘露糖被最大限度的保留。(3)在步骤(2)葡萄糖已被代谢的基础上，通过离心或超滤法分离酵母细胞，发酵液转入下一阶段生物转化。在上述过程中的发酵液体系中接入氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)在好氧条件下催化转化制备甘露糖酸(盐)。其中葡萄糖发酵产生的乙醇对氧化葡萄糖杆菌的发酵性能存在明显抑制作用但对甘露糖酸(盐)的得率有明显提升作用，未脱除乙醇发酵液甘露糖酸(盐)得率在70％以上。

【技术特征摘要】
1.一种多微生物分步发酵高效制备甘露糖酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)魔芋原料经过研磨后经的稀盐酸水解预处理，通过固液分离得到稀酸水解液其中包含大量的甘露糖和葡萄糖组分。(2)稀酸水解液经中和处理后接入酿酒酵母(Saccharomycescereiviase)或休哈塔假丝酵母(Candidashehatae)厌氧发酵生产生物乙醇。利用葡萄糖代谢阻遏抑制效应，葡萄糖被优先利用转化为乙醇，实时监测葡萄糖含量变化。当葡萄糖含量低于3g/L，则人工终止反应确保甘露糖被最大限度的保留。(3)在步骤(2)葡萄糖已被代谢的基础上，通过离心或超滤法分离酵母细胞，发酵液转入下一阶段生物转化。在上述过程中的发酵液体系中接入氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)在好氧条件下催化转化制备甘露糖酸(盐)。其中葡萄糖发酵产生的乙醇对氧化葡萄糖杆菌的发酵性能存在明显抑制作用但对甘露糖酸(盐)的得率有明显提升作用，未脱除乙醇发酵液甘露糖酸(盐)得率在70％以上。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐勇，周鑫，刘鑫露，勇强，朱均均，俞娟，李鑫，余世袁，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32