3′‑RACE接头引物及3′端未知基因序列的扩增方法技术

本发明专利技术公开了3′‑RACE接头引物及3′端未知基因序列的扩增方法。其中3′‑RACE接头引物具有由茎柄区、茎环区和PolyA结合区构成的茎环结构；茎柄区和茎环区具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；PolyA结合区设计15个、16个、17个、18个、19个或20个连续的胸腺嘧啶。本发明专利技术的3′‑RACE接头引物两段茎柄区序列碱基互补，形成茎环的柄部。柄部的碱基堆积使引物的稳定性增加，提高了逆转录效率。其双链结构和自身互补形成茎环构象，可避免逆转录引物与目的RNA模板发生杂交，减少背景干扰。在3′‑RACE接头引物茎环区还特别插入较多G/C碱基，提高其退火温度，减少PCR非特异性扩增。

RACE amplification method 3 'and 3' end joint primers of unknown gene sequence

The invention discloses a method for amplification of 3 'RACE adaptor primers and 3' end unknown gene sequence. The 3 'RACE adaptor primer has a handle stem area, stem loop region and PolyA binding region of the stem loop structure; stem handle area and stem loop region has a nucleotide sequence shown in NO.1 ID SEQ; PolyA binding region design 15, 16, 17, 18, or 19 20 consecutive thymine. The invention of the 3 'RACE adaptor primer two sequences stalks region complementary base, forming a stem loop handle. The base accumulation of the stem increased the stability of primers and increased the efficiency of reverse transcriptase. The double stranded structure and self complementation form the conformation of the stem ring, which avoids the hybridization between the reverse transcriptase primer and the target RNA template and reduces the background interference. In the 3 'RACE adaptor primer stem loop also insert more G/C bases, improve the annealing temperature, reduce PCR non-specific amplification.

【技术实现步骤摘要】
3′-RACE接头引物及3′端未知基因序列的扩增方法
本专利技术涉及一种3′-RACE接头引物及3′端未知基因序列的扩增方法。
技术介绍
cDNA末端快速扩增技术(RapidAmplificationofcDNAEnds，RACE)是一种根据目的基因已知的部分序列，通过逆转录和PCR的有机结合，从复杂且低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5′和3′末端的有效方法。利用基因编码区5′端的已知序列，获得3′端未知序列的技术称为3′-RACE，是目前扩增3′端未知基因序列的最常用技术。常规3′-RACE基本原理：利用3′-RACE接头引物对包含目的基因mRNA的RNA样品进行逆转录，获得包含目的基因的eDNA文库；然后利用目的基因已知序列设计基因特异性引物，与锚定引物(3′-RACE接头引物相匹配的引物)配对进行PCR扩增，获得3′端未知部分的片段。常规的3′-RACE存在一个共同的问题，逆转录所得的所有cDNA的5′末端(对应mRNA序列3′末端)都加上接头引物，获得3′-RACE通用模板。所有基因的mRNA序列3′末端均添加有接头引物，理论上包含所有mRNA对应的cDNA。利用通用模板作本文档来自技高网...

【技术保护点】
3′‑RACE接头引物，其特征在于：所述3′‑RACE接头引物具有由茎柄区、茎环区和PolyA结合区构成的茎环结构；所述茎柄区和茎环区具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述PolyA结合区设计15个、16个、17个、18个、19个或20个连续的胸腺嘧啶。

【技术特征摘要】
1.3′-RACE接头引物，其特征在于：所述3′-RACE接头引物具有由茎柄区、茎环区和PolyA结合区构成的茎环结构；所述茎柄区和茎环区具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；所述PolyA结合区设计15个、16个、17个、18个、19个或20个连续的胸腺嘧啶。2.根据权利要求1所述的3′-RACE接头引物，其特征在于：包括用于巢式PCR且与所述3′-RACE接头引物相匹配的锚定引物；所述锚定引物包括3′-RACE外侧引物和3′-RACE内侧引物；所述3′-RACE外侧引物具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，所述3′-RACE内侧引物具有SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的3′-RACE接头引物，其特征在于：所述3′-RACE外侧引物的3′端与3′-RACE内侧引物5′端至少含8bp的重叠序列。4.3′端未知基因序列的扩增方法，包括以下步骤：(1)根据目的基因已知的mRNA序列，设计参与3′端未知基因序列扩增的PCR引物；所述PCR引物包括参与逆转录反应的上游引物GSP1和用于巢式PCR的目的基因特异性引物；所述目的基因特异性引物包括上游外侧引物GSP2和上游内侧引物GSP3；(2)在逆转录体系中加入所述3′-RACE接头引物和上游引物GSP1，采用一步逆转录PCR，完成RNA→cDNA→PCR的扩增，得到PCR产物；(3)以步骤(2)获得的PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴明林，李海洋，侯冠军，蒋阳阳，高远，张智勇，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院水产研究所，
类型：发明
国别省市：安徽,34