中国毛虾蛋白降压肽及其制备方法与应用技术

中国毛虾蛋白降压肽及其制备方法与应用，属于海洋生物技术领域。本发明专利技术从中国毛虾的蛋白酶解产物中分离纯化出新的具有六个氨基酸的降压肽，具有较高的血管紧张素转化酶（ＡＣＥ）抑制活性。此外，根据体内酶的作用位点，对上述三种六肽可能的酶解产物短肽进行了化学合成，经ＡＣＥ抑制试验，筛选得到１２种序列的短肽具有很好的ＡＣＥ抑制活性。本发明专利技术降压肽用于制备降压药物。本发明专利技术将微生物酶工程技术应用于毛虾的深层次开发利用，得到的具有新序列短肽，具有高的ＡＣＥ抑制活力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从中国毛虾(Accedes chinensis)的酶解产物中分离纯化具有新的氨基酸序列的降压肽及其制备方法与应用，属于海洋生物

技术介绍
由食物蛋白经过部分酶解所得的短肽越来越引起食物学家的重视。这些短肽具有各种活性，比如提高免疫力，提高营养吸收率，抗高血压活性。具有这些活性的蛋白已经从食物蛋白酶解物中纯化出来，这些肽在蛋白质序列内是没有活性的，只有通过酶解或食物加工从蛋白中释放出来才具有活性。血管紧张素转化酶(ACE)是一种能够催化血管紧张素1转化成血管紧张素2的羧肽酶，能够导致血压升高，因此抑制ACE活性，可以导致血液中的血管紧张素2的浓度降低，从而导致血压降低。虽然人工合成的ACE抑制剂具有明显的降血压效果，但是副作用太大，因此现在必须找到更安全、新颖、高效的治疗高血压的药物。现在从不同的蛋。中通过不同的酶进行酶解，在其酶解物中发现了许多ACE抑制短肽，这些蛋白资源包括牛奶蛋白、大豆蛋白、鸡蛋蛋白、鸡肉蛋白、海洋鱼类蛋白、藻类等，到现在为止已有两百多中具有ACE抑制活性的酶解活性肽被报道，但是现在报道的ACE抑制短肽主要来源于陆地蛋白的酶解物，来源于海洋蛋白酶解物的报道较少，因此，今后，海洋生物蛋白酶解物将成为今后筛选新的ACE抑制肽的重要来源。毛虾是我国渤海湾水域的一种低附加值的海洋蛋白资源，每年的捕捞量达到30万吨，到目前为止，没有有效的开发利用，只是晒干制作虾皮或制作虾酱，产品的附加值较低。由于毛虾较高的蛋白含量和较低的脂肪含量，因此，毛虾是用于酶解的很好的蛋白资源，而且就毛虾的氨基酸组成来说，富含具有与降血压肽结构有关的支链氨基酸和芳香族氨基酸，是酶解分离降高血压肽的好原料。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种中国毛虾蛋白降压肽及其制备方法与应用。本专利技术从中国毛虾的蛋白酶解产物中分离纯化出新的具有六个氨基酸的降压肽，其序列分别为Phe-Cys-Val-Leu-Arg-Pro，Ile-Phe-Val-Pro-Ala-Phe或Lys-Pro-Pro-Glu-Thr-Val。具有较高的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性。考虑到上述三种六肽有可能在消化道内被进一步酶解，所以根据体内酶的作用位点，对上述三种六肽可能的酶解产物短肽进行了化学合成，经ACE抑制试验，筛选得到Cys-Val-Leu-Arg-Pro，Val-Leu-Arg-Pro，Phe-Cys-Val-Leu，Cys-Val-Leu，Arg-Pro，Val-Leu，Phe-Cys，Ile-Phe-Val-Pro-Ala，Phe-Val-Pro-Ala-Phe，Val-Pro-Ala-Phe，Val-Pro-Ala和Ile-Phe等12种序列的短肽具有很好的ACE抑制活性。纵上，本专利技术的中国毛虾蛋白降压肽是具有如下序列的短肽之一或组合Phe-Cys-Val-Leu-Arg-Pro肽1，Ile-Phe-Val-Pro-Ala-Phe肽2，Lys-Pro-Pro-Glu-Thr-Val肽3，Cys-Val-Leu-Arg-Pro肽4，Val-Leu-Arg-Pro肽5，Phe-Cys-Val-Leu肽6，Cys-Val-Leu肽7，Arg-Pro肽8，Val-Leu肽9，Phe-Cys肽10，Ile-Phe-Val-Pro-Ala肽11，Phe-Val-Pro-Ala-Phe肽12，Val-Pro-Ala-Phe肽13，Val-Pro-Ala肽14或Ile-Phe肽15。本专利技术中国毛虾蛋白降压肽的制备方法，包括从中国毛虾的蛋白酶解产物中分离纯化具有新的氨基酸序列的降压肽(ACE抑制肽)和进一步利用酶解液分离纯化ACE抑制肽。具体包括酶解毛虾制备酶解液、从酶解液中分离纯化降压肽、序列测定和降压肽的固相合成。上述酶解毛虾制备酶解液可用现有技术，本专利技术提供的方法是如下具体步骤中的(1)和(2)。下面详细说明本专利技术的各操作步骤，但不限于此(1)蛋白酶制剂的制备培养基饼粉2～3份、玉米粉2～3份、麸皮1～1.5份、Na2HPO40.4～0.5份、KH2PO40.03～0.04份、水100份，均为重量份，下同。灭菌，冷却，接种枯草芽孢杆菌SM98011(Bacillus.Subtilis SM98011)的茄子瓶菌种的菌悬液5～10份，通风搅拌，培养15～18小时，作为液体种子待用。液体深层发酵制备蛋白酶制剂培养基豆饼粉3～3.5份、玉米粉3.5～5.0份、麸皮2.0～2.5份、Na2HPO40.4～0.5份、KH2PO40.03～0.04份、水100份，均为重量份，下同。灭菌，接种上述步骤的液体种子，接种量为培养基重量的5～7％，通风搅拌，控温，发酵37～40小时，得蛋白酶制剂。酶活为4000U/ml。(2)酶解毛虾制备酶解液基本原料中国毛虾，按鲜重称取毛虾45～50份原料，打浆，然后加入液体重量45～50份的上述蛋白酶制剂，调pH值到6.8～7.3，温度45～50℃，搅拌酶解5小时。酶解完毕，离心取上清。(3)从酶解液中分离纯化降压肽(ACE抑制肽)用5000Da的超滤膜将酶解液超滤，将超滤小于5000Da的超滤液过PharmadexLH20柱(2.5×100cm，medium Pharmadex)，用蛋白核酸检测仪，在214nm处进行检测，根据从色谱柱分离得到的色谱峰分别收集，收集的洗脱液冻干称重后，测定ACE抑制活性，将抑制活性高的组分多次收集，然后进一步用高压液相色谱反相C18分离。PDA检测器检测波长为220nm，然后根据所得的肽的谱图将肽峰分别收集浓缩，测定ACE抑制活性，得到具有高的ACE抑制活力的肽。(4)序列测定将第三步分离得到的具有高的ACE抑制活力的纯肽，用氨基酸自动测序仪测定氨基酸组成，再通过液质连用仪分析3条肽的分子量和肽段的分布，分析出3条肽的氨基酸序列。序列分别为Phe-Cys-Val-Leu-Arg-Pro，Ile-Phe-Val-Pro-Ala-Phe或Lys-Pro-Pro-Glu-Thr-Val。(5)降压肽的固相合成根据人体内蛋白酶(胰蛋白酶，糜蛋白酶和胃蛋白酶)的酶切位点和上述3个分离纯化的肽，设计12条肽(原肽序列的一部分)Cys-Val-Leu-Arg-Pro，Val-Leu-Arg-Pro，Phe-Cys-Val-Leu，Cys-Val-Leu，Arg-Pro，Val-Leu，Phe-Cys，Ile-Phe-Val-Pro-Ala，Phe-Val-Pro-Ala-Phe，Val-Pro-Ala-Phe，Val-Pro-Ala和Ile-Phe。按现有技术固相合成，然后测定每一条肽的ACE抑制活性。结果证明固相合成的12条肽具有较高的ACE抑制活性。上述步骤(1)的培养基中加豆油0.3～0.35重量份作消泡剂。上述步骤(3)中测定肽的ACE抑制活性方法可用现有公知技术，如分光光度法或高压液相色谱法，本专利技术提供如下ACE抑制活性测定方法—毛细管电泳法10μl底物Hip-His-Leu(1mM)，0.8mU的血管紧张素转化酶(ACE)分别和若干10μl的0.03～40mg/ml中国毛虾酶解液混合为若干组样品。所述试剂都用100mM的硼酸缓冲液(包含0.3M NaCl，本文档来自技高网...

【技术保护点】
中国毛虾蛋白降压肽，其特征在于，是具有如下序列的肽１：Ｐｈｅ－Ｃｙｓ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ肽１，或在肽１中氨基酸序列经缺失一个或几个氨基酸衍生的肽４－肽１０，序列如下：Ｃｙｓ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ肽４，Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ肽５Ｐｈｅ－Ｃｙｓ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ肽６，Ｃｙｓ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ肽７，Ａｒｇ－Ｐｒｏ肽８Ｖａｌ－Ｌｅｕ肽９Ｐｈｅ－Ｃｙｓ肽１０。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉忠，何海伦，陈秀兰，吴昊，周百成，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]