脂质生产菌的育种方法及其利用技术

本发明专利技术是被孢霉（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属脂质生产菌的育种方法。更具体而言，采用包含抑制上述脂质生产菌中特定基因表达的表达抑制工序的脂质生产菌育种方法，能够高效且有效地进行被孢霉属脂质生产菌的育种。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及脂质生产菌的育种方法及其利用，特别涉及在被孢霉(Mortierella)属脂质生产菌中利用转化抑制基因表达从而进行脂质生产菌育种的方法及其利用。
技术介绍
一直以来，利用微生物代谢生产有用化合物的技术(广义的发酵技术)不断被开发并得到实际应用。具体而言，例如，可列举能够利用代谢大量生产脂质的脂质生产菌。作为代表性脂质生产菌，可列举高山被孢霉(Mortierellaalpina)等被孢霉属菌类。众所周知，上述被孢霉属菌类生产以花生四烯酸为主的多不饱和脂肪酸(PUFA)，是工业上非常有用的菌类(例如，参考专利文献1)。人们对包括上述脂质生产菌等微生物在内的各种有用生物进行育种，即，将有用生物的遗传性状改良成更令人满意的性状(品种改良)。特别是在发酵技术中，从提高微生物的化合物生产效率、降低该化合物的制造成本等观点出发，育种非常重要。育种方法基本上包括制备含有遗传性变异的群体的工序(方便起见，称为群体制备工序)和从该群体中筛选出表现期望性状的品种的工序(方便起见，称为筛选工序)。无论是群体制备工序还是筛选工序，均可根据所要育种的有用生物的种类，采用各种各样的方法，在上述脂质生产菌等微生物的群体制备工序中，主要利用(1)突变处理法和(2)转化法。(1)突变处理法利用突变处理进行群体制备工序时，用各种各样的方法使微生物产生突变从而制备群体，但突变本身会随机产生多种类型。因此，在之后的筛选工序中即使能获得表现目的性状的品种(株)，也可能使与目的性状相关的基因以外的其他基因产生预料之外的损伤。例如上述脂质生产菌，虽然所生产的脂质的种类改变，但有可能出现增殖和孢子形成能力等下降等。因此，在利用突变处理制备群体的工序中，不一定能获得生产性良好的菌株。而且在该方法中，如上所述，在形成所得到的群体的个体中，随机产生多种突变。因此，在之后的筛选工序中，当没有合适的筛选方法来获得表现目的性状的突变体(株)时，需对形成上述群体的全部个体的突变种类进行分析，这需要耗费庞大的劳力。(2)转化法与此相对，利用转化进行群体制备工序时，以所要育种的有用生物为宿主，为了获得目的性状，通过导入必须的DNA片段(转化)，得到转化体的群体。即，制备只控制与目的吻合的特定基因表达的群体。因此，在之后的筛选工序中，只要从得到的转化体中筛选出更令人满意的品种(株)即可，筛选变得容易，还可以避免上述其他基因产生预料之外的损伤。因此，可明显减少育种上花费的劳力。如上所述，在育种的群体制备工序中，优选转化法。例如，已有诸多关于被孢霉属菌类所属的丝状菌的转化方法的技术报道。具体而言，(a)非专利文献1～3等中公开了利用颗粒轰击法转化钩巢曲霉(Aspergillus nidulans)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)等丝状菌的技术。在这些技术中，用尿嘧啶缺陷性菌株作为转化的宿主株，同时采用与尿嘧啶缺陷性菌株互补的基因作为标记基因，选择转化株。另外，(b)作为上述高山被孢霉(M.alpina)的转化方法，已知有非专利文献4中公开的技术。在该技术中，将孢子原生质体化，利用电穿孔法将基因导入细胞内。而且，用来自大肠杆菌的潮霉素B抗性基因(hpt)作为标记基因筛选转化体。这样，可以筛选出转化体，即在含有潮霉素的培养基中能生长的菌株。另外，将有用生物的遗传性状改良成更令人满意的性状时，有时降低特定基因的功能，或使特定基因的功能缺失。此时，虽然利用上述(1)的突变处理法也可以获得特定基因的功能降低或缺失的突变株，但该突变处理法存在上述不利效果。因此，人们希望开发出这样的育种技术，即利用上述(2)的转化法，更简便切实地培育特定基因的功能降低或特定基因的功能缺失的突变株。这里，作为获得上述特定基因的功能降低或特定基因的功能缺失的突变株的技术，已知有抑制特定基因表达的技术。众所周知，这些技术有例如RNAi法、利用同源重组使染色体上的基因缺失的方法、共抑制法、反义技术等。特别是同源重组法，已知其效果稳定，而RNAi法是近年来为人所知的方法，已在多种生物中有报道，其效果也非常好。日本特公平7-34752(公告日平成7(1995)年4月19日、公开公报日本特开昭63-4489公开日昭和63(1988)年2月25日)Fungaro M.H.et al.Fems microbial Lett.，25，293-297，1995Herzog R.W.et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.，45，333-337，1996Armaleo，D.et al.Curr.Genet.，17，97-103，1990Mackenzie D.A.et al.Appl.Environ.Microbiol.，66，4655-4661，2000
技术实现思路
但是，没有任何关于在脂质生产菌被孢霉属菌类中抑制特定基因表达的基因表达抑制方法的报道。另外，例如上述RNAi法，已报道在多种生物中抑制基因表达，但在特定生物中RNAi法是否有效，须实际试验后才清楚。例如，没有关于在脂质生产菌被孢霉属菌类中RNAi法有效这样的报道。PUFA的大多数是必须脂肪酸，因参与生物体内复杂的生理功能，近年来成为备受关注的重要营养素。于是，人们渴求更高效地生产PUFA的发酵技术，为此，高效且有效地进行可靠性更高的脂质生产菌被孢霉属菌类育种的技术成为必需。鉴于上述课题完成了本专利技术，本专利技术的目的在于提供，抑制特定基因的表达从而有效且高效地进行被孢霉属脂质生产菌育种的育种方法及其利用。本专利技术人对上述课题进行了潜心研究，利用RNAi法，获得MAELO基因或Δ12脂肪酸去饱和酶基因的表达受抑制的被孢霉属突变株，对其进行功能解析后，发现该突变株分别是超长链饱和脂肪酸比例减少的菌株，或是生产Mead acid的菌株，从而完成了本专利技术。即，本专利技术作为产业上有用的方法或物质，包含下述1)～15)的专利技术。1)被孢霉(Mortierella)属脂质生产菌的育种方法，其包含抑制所述脂质生产菌中特定基因表达的表达抑制工序。2)根据1)所述的脂质生产菌的育种方法，所述表达抑制工序包含利用RNAi法抑制特定基因表达的RNAi工序。3)根据2)所述的脂质生产菌的育种方法，所述RNAi工序包含在所述脂质生产菌中导入重组表达载体的转化工序，该重组表达载体表达与所述特定基因具有的碱基序列的全部或部分对应的双链RNA。4)根据3)所述的脂质生产菌的育种方法，所述RNAi工序还包含构建所述重组表达载体的表达载体构建工序。5)根据3)或4)所述的脂质生产菌的育种方法，在所述转化工序中，采用电穿孔法或颗粒轰击法。6)根据1)～5)任意一项所述的脂质生产菌的育种方法，所述脂质生产菌是高山被孢霉(Mortierella alpina)。7)根据1)～6)任意一项所述的脂质生产菌的育种方法，所述特定基因是脂质代谢基因。8)根据7)所述的脂质生产菌的育种方法，所述脂质代谢基因是脂肪酸代谢基因。9)根据8)所述的脂质生产菌的育种方法，所述脂肪酸代谢基因是编码脂肪酸碳链延长酶或脂肪酸去饱和酶的基因。10)根据9)所述的脂质生产菌的育种方法，所述编码脂肪酸碳链延长酶的基因是GLELO基因或MAELO基因。11)根据9)所述的脂质生产菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
脂质生产菌的育种方法，其是被孢霉（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属脂质生产菌的育种方法，其特征在于：包含抑制所述脂质生产菌中特定基因表达的表达抑制工序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：落合美佐，河岛洋，清水昌，樱谷英治，
申请(专利权)人：三得利株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]